衔接蛋白APPL1调控胰岛β细胞功能及胰岛素分泌的作用及分子机制研究

Insulin resistance and defective insulin secretion are the two key features of type 2 diabetes. β cell dysfunction, which is characterized by defective glucose-stimulated insulin secretion (GSIS), is observed at the early stage of type 2 diabetes mellitus (T2DM). The adaptor protein APPL1 mediates both metabolic and vascular actions of insulin, including suppression of glucose production in liver, stimulation of glucose uptake in skeletal muscle and adipocytes and augmentation of endothelium-dependent vasodilatation. Our recent study found that expression level of APPL1 in pancreatic β cells is significantly decreased in several mouse models of obesity and diabetes. APPL1 knockout mice exhibit glucose intolerance and impaired GSIS, whereas transgenic expression of APPL1 prevents high fat diet-induced glucose intolerance partly by enhancing GSIS, suggesting APPL1 as an obligatory molecule in regulating action and secretion of insulin. In this project, we utilize transgenic mice with β cell specific over-expression of APPL1 to comprehensively investigate the patho-physiological roles of APPL1 in controlling β cell mass and insulin secretion under both healthy and diabetic conditions, and to elucidate the detailed molecular and structural basis whereby APPL1 modulates nutrients-stimulated insulin secretion. The results from this study are expected to shed new light on the pathogenesis of β cell dysfunction in T2DM, and to provide scientific evidence for developing novel therapeutic agents for T2DM.

外周胰岛素抵抗与胰岛β细胞功能障碍是2型糖尿病最重要的发病因素。β细胞功能异常出现在2型糖尿病的早期，主要为葡萄糖刺激的胰岛素分泌障碍。APPL1参与胰岛素信号转导通路,在代谢和血管中具有重要作用。我们最近的研究发现，APPL1在肥胖及糖尿病小鼠模型的胰岛细胞中，其表达水平明显下调。APPL1基因剔除小鼠β细胞中葡萄糖刺激的胰岛素发生明显分泌障碍。相反, APPL1转基因小鼠葡萄糖刺激β细胞分泌胰岛素的能力显着增加。这些结果表明APPL1参与胰岛素分泌调控,但其作用机制仍不清楚。本项目拟采用本实验室的β细胞特异性APPL1转基因小鼠为研究对象,进一步阐明APPL1在糖尿病中对胰岛细胞功能的保护作用及其机理。并探讨APPL1是否在胰岛素信号传导通路中起着关键的枢纽作用。研究结果将有助理解糖尿病中胰岛细胞功能紊乱的病理分子机制,并为发展以促进胰岛素分泌为靶标的抗糖尿病药物提供理论基础。

研究证实APPL1可以通过调节胰岛素的分泌和功能来控制体内糖代谢的平衡，而APPL1如何调节胰岛细胞的生长与凋亡及其作用机理尚不清楚。利用野生鼠和APPL1基因敲除小鼠作为模型，我们证实APPL1基因敲除的小鼠对链脲霉素（STZ）诱发的糖尿病更为敏感，表现出更高的随机血糖水平和葡萄糖耐量异常，以及更为严重的炎症反应。.与体内实验观察到的现象一致，与取自于野生型小鼠的胰岛相比，体外培养的APPL1缺陷的胰岛对细胞因子鸡尾酒（IL-1β，TNF-α和IFN-γ）处理更加敏感，表现为caspase 3，一氧化氮和MCP-1水平上升以及iNOS，FAS，BAX等基因表达的显著升高。.我们利用siRNA转染的方法降低INS-1E细胞中APPL1的表达，从而进一步研究APPL1对β细胞的保护机制。与体外胰岛培养所观察到的现象一致，降低APPL1的表达水平会加剧细胞因子鸡尾酒处理引起的INS-1E细胞中caspase 3，一氧化氮和MCP-1水平的升高以及炎症相关基因的表达。降低APPL1的表达可以显著增强NFκB启动子的活性，以及NFκB亚基p65与包含NFκB应答元件的目标基因的结合。利用iNOS抑制剂L-NIL可以成功抑制细胞因子鸡尾酒处理导致的caspase 3水平在野生型小鼠和APPL1敲除的小鼠的胰岛中的升高。.为了进一步证明APPL1对β细胞的保护作用，我们利用注射腺病毒的方法将APPL1在胰岛中特异性过表达，而此方法可以有效的减弱STZ引起的糖尿病症状，例如血糖升高和葡萄糖耐量异常；而免疫组化的结果表明，在STZ处理后APPL1过表达的胰腺的胰岛素含量明显高于GFP对照组。我们还发现APPL1过表达可以通过减弱STZ引起的β细胞凋亡，从而保持β细胞数量相对稳定。为了进一步验证胰腺内APPL1过表达对β细胞的保护作用，我们构建了RIP-APPL1转基因小鼠。在STZ注射后，与腹腔注射腺病毒过表达APPL1观察到的现象一致，STZ注射引起的血糖升高在APPL1转基因小鼠中得到明显的缓解。.以上的研究结果表明，APPL1可以通过抑制NFκB-iNOS-NO通路调控β细胞的凋亡和炎症反应，此结果表明APPL1具有潜在治疗1型糖尿病的价值。.本课题目前为止进展非常顺利，成果在2015年在德国举行的糖尿病学大会报告及在糖尿病研究领域的优秀期刊Diabetologia发表。