PD-1/PD-L1拮抗肽的筛选及其在肿瘤免疫治疗中的应用研究

PD-1和它的配体PD-L1是T细胞活化过程中一对重要的负性共刺激分子，在诱导T细胞无能和免疫耐受维持方面起着非常重要的作用，并与肿瘤免疫耐受和逃逸相关，因此，研究利用PD-1和PD-L1作为肿瘤免疫治疗的靶点具有重要的理论意义和应用价值。本项目拟通过噬菌体展示肽库的方法，分别高通量的筛选针对PD-1和PD-L1的拮抗肽，利用凝胶迁移电泳和表面等离子共振技术分析拮抗肽与PD-1和PD-L1的亲和力，进行结构优化与改造；通过体外刺激和转基因小鼠体内免疫两种方法进行CTL诱导，利用细胞因子ELISPOT实验、LDH释放实验和流式技术分析探讨拮抗肽的作用机制和作为抗肿瘤免疫佐剂的可能性；通过野生型小鼠和转基因小鼠两种荷瘤模型分别研究拮抗肽单独应用和作为抗原肽免疫佐剂的体内抗肿瘤作用，并对其作用机制和毒副作用进行研究。本研究将为基于PD-1/PD-L1的药物研究和开发提供新的思路和理论基础。

PD-1/PD-L1作为T细胞活化过程中一对重要的负性共刺激分子，在诱导T细胞无能和免疫耐受维持方面有重要作用，并与肿瘤免疫耐受和逃逸相关，是肿瘤免疫治疗的明星靶点。本项目首先运用基因工程的方法获得PD-1/PD-L1的重组表达载体pET28a-hPD-L1、pET15b–hPD-L1 IgV和pET28a-hPD-1，并获得高纯的靶标蛋白。通过噬菌体展示肽库的高通量筛选方法，获得了一系列针对PD-1和PD-L1的拮抗肽，利用酶联免疫吸附测试(ELISA)和表面等离子共振技术（SPR）分析拮抗肽与PD-1和PD-L1的亲和力，并选择高亲和力的P1肽进行结构优化改造。细胞增殖MTT实验证明筛选的拮抗肽不能直接影响肿瘤细胞的生长。通过流式分析了解不同肿瘤细胞PD-L1的表达情况，并挑选高表达PD-L1的肿瘤细胞B16和CT26建立相应的小鼠移植瘤模型，对拮抗肽进行体内活性分析，结果证明拮抗肽P1在降低肿瘤生长和延长小鼠生存期方面显示出较好的抗肿瘤活性。本研究为PD-1和 PD-L1作为肿瘤免疫治疗药物开发提供了理论基础。