双基因共转化定向调控木质素合成流向

Directional regulating lignin biosynthesis flux towards S lignin synthesis could increase both the percentage of S lignin and S/G ratio, and reduce pollution and costs by enhance pulpability，which is significant for the improvement of pulpwood. Base on the previous study of applicant, this subject supposed to pair and cotransform F5H,COMT and CCoAOMT which cloned from Eucalyptus urophylla clone GLU4. The gene pairing design as “F5H upregulation-COMT upregulation”, “F5H upregulation–CCoAOMT downregulation” and “COMT upregulation -CCoAOMT downregulation”. Dual gene would be cotransformated to tobacco simultaneously by use of bidirectional expression vector. The transgenic plant would be analysed for mRNA expression, substrate content，lignin constituent and lignin content, in order to evaluate the regulation effect of dual gene cotransformation. The implementation of this subject could offer help for intensive study on the effect on lignin biosynthesis by regulate F5H,COMT,CCoAOMT and the strategy optimizing for lignin biosynthesis directional regulation, and guide the transgenic evolve on wood property in Eucalyptus urophylla clone GLU4. For another, it could verify the function of the bidirectional expression vector, perfecting the bidirectional expression vector based dual gene cotransformation technique, and provide effective reference for other research on metabolism synthesis in plant.

定向调控木质素合成流向，提高S木质素比例和S/G比值，可以提高制浆性能，达到减少制浆污染并降低成本的目的，对纸浆材性状改良意义重大。根据申请者前期研究基础，本研究采用双向表达载体将尾叶桉GLU4的F5H 、COMT、CCoAOMT基因按照F5H上调-COMT上调、F5H上调-CCoAOMT下调、COMT上调-CCoAOMT下调的组合设计，双基因共转化烟草，研究转化植株中目的基因mRNA 表达量、合成途径中底物流向、木质素成分及总量变化，分析双基因共转化对木质素合成流向的定向调控效果。通过本研究的实施，一方面可以深入研究F5H、COMT、CCoAOMT基因对木质素合成的作用机制，优化定向调控S木质素合成的研究策略，为尾叶桉GLU4无性系转基因性状改良提供指导；另一方面可以进一步验证双向表达载体功能，完善基于双向表达载体的双基因共转化研究技术，为其他植物代谢合成领域的研究提供有效的技术参考。

本研究按照研究计划，利用分别携带EuF5H、EuCOMT基因的正义片段、EuCCoAOMT的RNAi片段的单基因植物表达载体，以及用双向表达载体构建的双基因植物表达载体，通过农杆菌介导转化烟草获得了转基因植株。对转基因植株中目标基因的表达水平进行了荧光定量PCR检测，发现转入的两个基因的正义片段可以正常表达，RNAi片段也如预期的强烈抑制了目标基因的表达。茎部结构切片观察结果显示，转基因植株茎部生长、细胞结构等表型与野生型无显著差异。木质素、纤维素含量以及茎部组织切片的木质部测量结果一致显示，与野生型相比，转基因植株的木质素含量和木质部厚度表现出轻微地改变。. 木质素单体检测结果反映出基因转化显著地影响了单体合成，除EuCOMT正义片段的转化植株外，都达到了预期的提高S/G比值的调控效果，但调控幅度略有不同。总结参试植株的单体合成调控情况发现，在烟草中EuF5H的正义表达，促进了S木质素的合成，并对G木质素合成有轻微的抑制作用；EuCCoAOMT的RNAi片段，对烟草S木质素的合成影响不大，但对G木质素的合成强烈的抑制效果；在烟草中正义表达EuCOMT，则在基本不影响S木质素合成的同时，提高了G木质素的合成。同时发现，双基因共转化的植株，其木质素单体合成调控结果，并不是单基因转化效果的简单加成，有些甚至出现相反的趋势。在参试的3个双基因组合中， EuF5H正义片段和EuCCoAOMT的RNAi片段的组合表现出S木质素的大幅提高和G木质素的剧烈降低，S/G比值比野生型提高约3倍，说明F5H上调和CCoAOMT下调的调控方式对S/G比值的定向调控效果最佳。. 通过本研究，一方面为后续的尾叶桉转基因调控木质素合成研究提供了最直接有效的研究基础和技术参考，另一方面，将双向植物表达载体引入了功能基因转化的研究应用当中，证实了其科学有效性，也为其在其他植物基因的研究中开启了应用之路。