产乳化蛋白工程菌修复PCBs污染土壤的效能及微生态效应

本项目以提高PCBs污染土壤原位生物修复效率为目标，将乳化蛋白基因alnA整合至PCBs降解菌Pseudomonas sp.DN2基因组中，构建PCBs原位生物降解过程中耦合产生生物表面活性剂的基因工程菌。在室内模拟条件下，考察乳化蛋白AlnA溶解PCBs的性能及分子机制、环境与调控因子对工程菌产生AlnA的影响；建立AlnA对土壤中PCBs的解吸模型，阐明工程菌修复PCBs污染土壤过程中土壤微生物量周转及群落演替规律。明确工程菌修复PCBs污染土壤的效能及对土壤微生态系统的影响。本研究可获得多功能PCBs降解菌株，有助于PCBs污染土壤原位生物修复效率低下问题的解决，具有明确的现实意义。并对指导生物修复的合理运作具有重要的理论意义。

成功的从抗辐射不动杆菌（Acinetobacter radioresistens）中克隆到了编码生物乳化剂alnA 的基因，并将其在BL21（DE3）plys宿主菌中进行了高效表达，并通过亲和层析、透析及western blot和质谱分析获得了电泳纯的目的蛋白；测定了AlnA 蛋白对不同PCBs的溶解活性，发现AlnA 在20ug/mL的浓度下就可将不同氯取代的PCB晶体增溶1.87-6.12倍，其性能远优于常用表面活性剂吐温80和环糊精。进一步利用分子模拟与对接技术解析AlnA与PCBs分子间相互作用发现，氯原子取代数越高，与AlnA的结合能越强。分析ALnA的表面活性剂特性表明，其最小表面张力为37.89mN/m，及其面临界胶束浓度为1.07g/L. 考察ALnA在土壤中的吸附解吸动力学表明，其行为可用Freundilich方程描述，其相关性为0.99，并且Freundilich常数和异质因子为6.87和0.563.相对于吐温80和鼠李糖脂，ALnA表现出对土壤中PCBs优异的解吸性能。植物提取实验证明，ALnA可有效促进苜蓿对土壤中PCBs的解吸。GFP标记的工程菌株与出发菌株相比，降解性能差别不大。经历60天修复后表明工程菌在土壤中可有效定殖。比较土壤中PCBs去除率表明，2,2′/2,6在四种处理中去除率相近。但对于三氯代同系物，工程菌处理和加入AlnA处理的去除率均明显高于不加菌和加DN2处理。其中对占变压器油质量百分比9%以上的2,5, 2′-PCB,可去除80%以上。利用Biolog和DGGE分析土壤微生物群落结构的变化，发现向土壤中施加AlnA、DN2和工程菌均能明显导致土壤原始微生物群落结构发生改变，其微生物多样性明显增多。对比来看，加入AlnA与加入DN2后微生物群落结构相似，但加入AlnA的样品中优势种群的丰度明显高于加入DN2的土壤。加入工程菌后的微生物群落结构与加入AlnA和加入DN2的差异较大。在加入AlnA和加入DN2的土壤中，某些种群趋于消亡，而在加入AlnA和加入DN2土壤中没有出现的一些微生物种类，形成了优势种群。