四倍体刺槐凝集素TRpL1耐盐碱特性与功能研究

Soil salinity and alkalinity is one of the main abiotic stresses that restrict the development of agriculture worldwide. How to improve crop salt tolerance, make good use of salinity-alkalinity soil has become the major task for solution. In our former study on proteome of leaf mitochondria of a salinity and alkalinity stress tolerant woody plant, Tetraploid black locust (Robinia pseudoacacia L.), a lectin was found to specially expressed in Tetraploid, and the expression was increased with the strengthen of NaCl stress, while has no expression in the diploid. It is presumed that this lectin is related with the fact of Tetraploid possess higher salinity and alkalinity stress tolerance than the diploid; and it might play a critical role in the molecular mechanism of salinity and alkalinity stress tolerance of the Tetraploid. Based on the above findings, in present project, we plan to study with this lectin. First, the lectin gene, TRpL1, will be cloned and transformed into the genome of Arabidopsis thaliana, and the biological characters and TRpL1 gene expression characters of transgenic plants under salinity and alkalinity stress will be investigated. Then the recombined TRpL1 protein will be expressed and purified via the prokaryotic expression system, and the antibody will also be prepared. Further, the whole protein expression pattern and TRpL1 protein expression characters in TRpL1 gene transgenic plants under salinity and alkalinity stress will be analyzed via proteome and immunoblot analysis. Proteins regulated by TRpL1 or interact with TRpL1 will also be explored and screened out. This study will clarify the salinity and alkalinity stress tolerance characters and functions of TRpL1.

目前土壤盐碱化问题已经危及全球。如何提高植物耐盐性、有效利用盐碱土资源已成为亟待解决的重大课题。在前期研究中我们考察NaCl胁迫下耐盐碱植物四倍体刺槐线粒体蛋白质组变化，发现一个植物凝集素在四倍体中特异性表达，且随胁迫强度增大而表达增强；但在二倍体中不表达。推测这与四倍体刺槐耐盐性强于二倍体有关，并且在其耐盐机制中发挥重要作用。基于上述发现，本项目拟以该凝集素为研究对象，利用分子克隆得到其基因TRpL1，并将TRpL1转入拟南芥基因组，研究盐碱胁迫下转TRpL1拟南芥的生物学特性与TRpL1转录表达谱；利用原核表达纯化TRpL1蛋白，并精制其抗体；利用蛋白质组和免疫印迹方法研究盐碱胁迫下转TRpL1拟南芥植株中蛋白表达谱特性以及TRpL1蛋白的表达特性，挖掘受TRpL1调控或与其发生相互作用的功能蛋白。本研究将初步明确四倍体刺槐凝集素TRpL1的耐盐碱特性与功能。

目前土壤盐碱化问题已经危及全球。如何提高植物耐盐性、有效利用盐碱土资源已成为亟待解决的重大课题。基于前期蛋白质组实验结果，本项目研究自NaCl胁迫下的耐盐碱植物四倍体刺槐中克隆得到一个凝集素基因TRpL1，并对其进行了初步研究，主要结果如下：.1.利用生物信息学方法分析TRpL1蛋白的结构特点，预测了信号肽、结构域、亚细胞定位、修饰位点等，并将其与已知的植物凝集素序列进行同源性比对与进化树分析，初步了解了其生物学与功能特性。.2.利用GFP荧光标记发现TRpL1蛋白定位于叶绿体或细胞膜上。.3. 构建了重组蛋白原核表达载体pQE-TRpL1，通过优化原核表达纯化条件获得足量的重组TRpL1蛋白，为制备抗体以及下一步盐碱胁迫下转TRpL1拟南芥中TRpL1蛋白的表达谱研究和盐碱胁迫下转TRpL1拟南芥的蛋白质组学研究提供了材料基础。.4. 利用原核表达模型考察了TRpL1蛋白表达提高大肠杆菌抵抗盐胁迫的能力，结果表明，在对照条件下（0 mM NaCl），pQE-TRpL1和pQE-30的生长曲线基本一致；在NaCl胁迫下，pQE-TRpL1的生长高于pQE-30空载体，尤其在较高浓度 NaCl（800、1000 mM）、以及胁迫中后期（4-12h）这种趋势更加明显。这说明TRpL1蛋白的表达可以提高大肠杆菌对盐的耐受性。.5. 采用q-PCR方法分析了盐碱胁迫下TRpL1基因在刺槐叶片中的表达谱。结果表明，与对照相比，400 mM NaCl处理后的二倍体和四倍体刺槐中TRpL1基因表达量都升高，但四倍体表达量高于二倍体，推测二倍体和四倍体刺槐中的TRpL1都响应NaCl盐胁迫，但四倍体中TRpL1对盐胁迫胁迫响应可能比二倍体更加敏感，这种表达差异或者与四倍体耐盐能力高于二倍体有关。200 mM NaHCO3胁迫后，二倍体和四倍体TRpL1基因表达量均略有升高，但与对照相差不大，推测可能是植物对NaHCO3胁迫与NaCl胁迫的响应机制不同，二倍体和四倍体中TRpL1对NaHCO3胁迫响应不明显。.6. 构建了植物过表达载体35S::TRpL1-GFP，制备拟南芥转基因植株，T3代转基因植株耐盐性实验说明过表达转TRpL植株耐盐性高于野生型，TRpL1是一个潜在的耐盐性功能蛋白。.本研究将初步明确TRpL1的耐盐碱特性与功能并为木本植物耐盐性种质资源的开发与利用提供借鉴。