一个簇毛麦类钙调素互作蛋白激酶基因（HvCIPK1）的功能分析

类钙调素互作蛋白激酶基因(CIPK)是植物Ca2+信号传导过程中的关键元件，作为早期调控基因对提高植物抗逆性有重要价值，但目前CIPK在麦类作物中的功能和作用机制尚不明确。本实验室在高抗小麦白粉病、耐盐、抗旱的簇毛麦中克隆了一个CIPK基因（HvCIPK1），外源Ca2+和白粉菌均诱导该基因上调表达，推测其在抗逆过程中发挥作用。本项目将进一步分析HvCIPK1在不同逆境胁迫下的时空表达特性；采用瞬间表达和病毒介导的基因沉默技术，研究HvCIPK1在簇毛麦中与白粉菌的互作特性，结合细胞内游离Ca2+的动态显微观测，了解该基因的功能及作用模式；利用酵母双杂交、双分子荧光互补技术筛选其互作蛋白，为阐释簇毛麦中CIPK所在的信号通路提供依据；对已获得的转HvCIPK1小麦进行抗白粉病、耐盐、抗旱等综合鉴定，评价其在抗逆基因工程育种中的应用价值，为培育兼抗多种逆境胁迫的转基因小麦新品种奠定基础。

本项目围绕在簇毛麦中克隆的定位于高抗白粉病Pm21基因染色体区段的一个类钙调素互作蛋白激酶基因（HvCIPK1）开展了功能鉴定和抗性分子机制的研究。（1）表达特征研究表明：该基因在簇毛麦幼叶和根中的表达量较高，不仅在叶部受白粉菌以及水杨酸、乙烯利等外施植物激素的诱导上调表达，而且在叶部和根部受低温、高盐、干旱、外施钙离子胁迫诱导均显著上调表达，可见该基因广谱地参与了簇毛麦抗逆性的早期反应。（2）将HvCIPK1基因与GFP基因序列连接的融合表达载体，导入洋葱表皮细胞和簇毛麦叶肉原生质体细胞，该基因的蛋白产物均定位于细胞膜、细胞质和细胞核中。（3）同源克隆获得簇毛麦中HvCIPK1特异结合蛋白CBL家族基因4个，在酵母中验证HvCBL3与HvCIPK1之间互作效果最强，两者蛋白共定位于细胞核和细胞膜上。（4）以HvCIPK1作为诱饵，在白粉病菌诱导的簇毛麦酵母双杂交文库中筛选有互作的底物蛋白，共获得阳性克隆48个，其中包括与植物抗病性相关的水稻中BIANK1和BBD1基因的同源基因等，并通过酵母回转验证了互作的真实性。（5）通过根吸收法用外施钙离子激活钙信号通路，同时可诱导HvCIPK1基因上调表达。而用钙离子通道抑制剂氯化镧处理后，含Pm21基因的抗病小麦的抗病性部分丧失。（6）通过病毒介导方法沉默簇毛麦中内源HvCIPK1基因，发现其抗白粉病的表型部分丧失，说明该基因是抗白粉病所必需的信号基因。（7）在感病小麦叶片中瞬间过量表达HvCIPK1基因的能够显著降低与白粉菌互作细胞的吸器指数，提高其白粉病抗性，而瞬间过量表达突变的HvCIPK1基因则不能降低吸器指数。（8）获得抗性提高的T4代稳定转基因系9个，转基因系还表现出一定程度的赤霉病抗性和耐盐性的提高。综上所述，HvCIPK1基因是小麦白粉病抗性的正调控因子，该基因介导的钙信号通路参与了Pm21基因介导的广谱抗白粉病途径，因此HvCIPK1基因在小麦抗逆基因工程及育种中具有重要的应用价值。