石墨烯水凝胶负载EPCs来源外泌体调控PI3K-AKT通路修复颌骨缺损的研究

Reconstruction of jaw defects is an urgent problem to be solved in the field of oral and maxillofacial surgery, and the application of tissue engineering bone is an effective means to solve this obstacle. In our previous study, we have successfully prepared novel biocompatible graphene tissue engineering scaffolds (Self-Supporting Graphene Hydrogel，SGH) ,and revealed its good osteoinductive properties, but it is not the ideal time in the body into blood vessels. The lack of adequate blood supply not only affects the proliferation and differentiation of seed cells, and even make the transplanted tissue engineering bone impossible to work effectively. We observed that exosome secretion of endothelial progenitor cells can promote angiogenesis in improvement of vascularization experiments, so this project was designed to explore the vascularized osteogenic potential of vascularized tissue engineering bone (SGH-exo) and its possible mechanism by creating exosomes and graphene hydrogel complex: 1) to construct the above-mentioned tissue-engineered bone and observe the osteogenic ability of mesenchymal stem cells in vitro; 2) to investigate the ability of SGH-exo to load and release exosomes, and verify its regulation of PI3K-AKT pathway in osteogenic process by using RNA-Seq analysis on differentially expressed genes and enrichment pathways; 3) to apply it to the repair of rat mandibular defect and evaluate its ability to vascularize osteogenesis in vivo that providing an improved solution to the problem of vascularization facing the application of tissue engineering bone.

颌骨缺损重建是颌面外科领域亟待解决的问题，组织工程骨的应用是解决该问题的有效手段。前期课题组成功制备生物相容性优良的新型骨组织工程材料——自撑式石墨烯水凝胶（SGH），并首次揭示其良好的骨诱导性，但其成血管能力并不理想。缺乏充足的血供不仅影响种子细胞增殖分化，甚至会使组织工程骨失效。改善血管化实验中我们观察到内皮祖细胞外泌体能促进血管新生，故本项目拟将该外泌体与石墨烯水凝胶复合形成可促血管化的组织工程骨（SGH-exo），通过下列研究来探讨其血管化成骨能力及可能机制：1）构建上述组织工程骨，观察其体外接种间充质干细胞后的成骨成血管能力；2）研究SGH-exo负载和释放外泌体能力，采用RNA-Seq分析差异表达基因和富集通路，并验证其在成骨成血管过程中对PI3K-AKT通路的调控作用；3）将其应用于大鼠颌骨缺损修复，评估其体内血管化成骨能力；以期为组织工程骨应用面临的血管化问题提供改进方案。

颅颌面骨缺损重建是口腔颌面外科领域研究的热点问题，组织工程骨的应用是解决该问题的有效手段。前期课题组成功制备了生物相容性优良的骨组织工程材料自撑式石墨烯水凝胶（SGH），并首次揭示其良好的骨诱导性。此外，课题组预实验结果结合相关文献提示内皮祖细胞外泌体(EPC-sEVs)具备促进血管化同时促进BMSCs成骨的可能性。因此本项目采用EPC-sEVs作为骨组织工程材料搭配的sEVs应用于骨缺损修复的研究，并通过一系列体内外实验来验证其促进成骨的效果和相关机制。. 本项目从改进骨组织工程材料出发，制备了氨基化改性自撑式石墨烯水凝胶(ASGH)，检测其物理化学性能并评价其生物相容性和对EPC-sEVs的负载、缓释能力；验证了ASGH在负载EPC-sEVs后对大鼠BMSCs成骨分化的促进作用以及对大鼠颅骨骨缺损的修复效果；研究EPC-sEVs促进BMSCs成骨分化的机制，通过转录组测序和miRNA测序来分析EPC-sEVs传递到BMSCs中的miRNA同BMSCs中靶基因相互作用的网络关系；通过抑制EPC-sEVs内rno-let-7d-5p和过表达BMSCs内Sfrp4来研究rno-let-7d-5p调控Sfrp4对BMSCs成骨分化的影响；同时研发适合石墨烯水凝胶包埋的新型快速硬组织包埋方法。研究结果表明：(1)ASGH具备良好的生物相容性和机械性能，并且拥有优良的负载和缓释EPC-sEVs的能力；ASGH负载EPC-sEVs能促进大鼠BMSCs的成骨分化并且有利于大鼠颅骨骨缺损的修复，其中EPC-sEVs发挥了主要的作用。该结果为石墨烯水凝胶和EPC-sEVs在骨再生领域的应用提供了新的研究方向和思路。(2)EPC-sEVs可能通过传递rno-let-7d-5p来下调Sfrp4表达、激活Wnt通路从而促进BMSCs的成骨分化。本研究对于EPC-sEVs促进BMSCs成骨分化机制的初步探讨，为深入认识EPC-sEVs的生物学功能提供了宝贵的理论数据。(3)研发的新型快速硬组织包埋方法可以在完好地包埋骨组织的同时，很好地保留石墨烯水凝胶的形状和性能，该方法的应用能够更有效地观察骨与石墨烯之间的相互作用，为石墨烯类材料在骨再生领域应用的研究提供了优化的实验技术。