重金属污染土壤抗生素抗性基因分布特征和质粒转移规律研究

Conjugation is generally considered the most important HGT mechanism for transfer of antibiotic resistance between different bacterial even pathogens which confers great threats for human health. Stressors like metals can co-select for antibiotic resistance and modulate the potential for plasmid transfer within specific bacterial groups which promotes the spread of antibiotic resistance in the environment. In this project, the effect of long-term heavy metal contamination in soil bacterial community permissiveness towards conjugal plasmids will be analyzed by high-resolution fluorescence activated cell sorting (FACS) and 16S rRNA gene sequencing. Bacterial permissiveness will be analyzed at community level, OTU level to illustrate the effect of environmental stressors on conjugal plasmid transfer among different bacterial communities. Besides, the diversity and richness of different antibiotic resistance genes in metal contaminated soil bacteria communities will be quantified by high throughput quantitative PCR. The aim of the study is to illustrate the effect of metals on the accumulation and dissemination of antibiotic resistance genes in soils bacterial communities and provide scientific basis and optimal management for elimination and mitigation of resistance genes.

质粒介导的接合转移过程被认为是抗生素抗性基因水平转移的最主要的作用机制，进一步导致抗生素抗性基因在不同的微生物之间，甚至致病菌和非致病菌之间相互传播，严重威胁着人类健康。环境中的重金属通过共选择作用促进抗生素抗性基因的累积，同时也能够调控接合质粒在不同土壤微生物之间的转移过程而影响抗生素抗性基因在环境中的扩散。因此，本项目拟以废弃铜矿区多种重金属长期污染土壤为研究对象，基于高效流式细胞仪分选技术以及高通量测序技术研究长期重金属污染对土壤微生物群落质粒开放度的影响，系统分析群落水平、OTU水平质粒接收度的变化，同时采用高通量荧光定量PCR分析抗生素抗性基因丰度及分布特征，全面系统地阐述重金属污染对土壤环境中抗生素抗性基因分布特征和扩散机制的影响，以期为有效地控制抗性基因在环境中的传播扩散提供科学依据。

重金属作为重要的环境因子，能够显著影响ARGs的产生（“共选择”）和传播（“基因水平转移”）。因此，本研究以这两个过程为主要研究对象，首先通过测定供试质粒从供体细胞到受体土壤细菌群落的质粒转移频率分析污染对细菌群落质粒转移能力的影响，随后通过16S-rRNA基因扩增子测序对转化结合子群落进行分析测定，从而对OTU水平质粒接收能力的变化进行分析。此外，设置不同浓度的重金属污染处理，以及添加不同生物和有机改良剂的重金属污染土壤，通过高通量qPCR定量或宏基因组测序技术分析不同处理对抗生素抗性基因丰度和多样性的影响，同时对土壤微生物群落进行16s-rRNA基因扩增子测序，分析细菌群落组成变化。结果发现：.1)从高污染土壤中提取的细菌对IncP-1质粒的转移频率低于从低铜对照土壤或低浓度重金属污染的土壤中提取的细菌，并且不同污染程度处理下的转化结合子群落具有高度的相似性。OTU 水平的群落开放度几乎不受污染程度的影响，微生物群落中特定的OTU能够接受IncP-1质粒，并且这一过程具有一定的随机性，因此在预测ARGs是否会随着质粒转移过程在环境中不断传播这一结论是具有一定的难度。.2）重金属胁迫可以提高土壤中的生物有效铜的含量从而提高细菌群落对铜和四环素的耐受性，而粪肥处理则没有明显作用。此外，铜和猪粪处理对土壤中ARGs和MGEs的绝对丰度有显著影响，同时Cu处理和施用粪肥的处理存在交互作用。ARGs和不同类别的细菌群体的共现模式表明相同的ARGs可以在不同的细菌门类中存在，其中可能的原因是ARGs在不同种类细胞之间水平转移。.3）有机改良剂对重金属的有效性有显著影响，进而影响土壤中ARGs的分布。而生物改良剂对土壤中各类ARGs的丰度均无明显影响，壳聚糖显著增加了多药耐药和β-内酰胺类抗性基因的丰度，黄腐酸钾会诱导产生磺胺类抗性基因，生物改良剂和有机改良剂的复合处理可对某些ARGs的丰度产生显著的交互作用。