异甜菊醇通过PKC-β-SREBP1C-SCD1/GPAT通路改善非酒精性脂肪肝病脂质沉积的机制研究

Previously, we found that Isosteviol protected non-alcohol fatty liver disease through PKC-β/p66Shc/ROS pathway. Isosteviol inhibited p66Shc mitochondrial translocation, ROS product, decrease endoplasmic reticulum stress and inhibited mitochondria-endoplasmic reticulum interaction to protect HFD- and PA-induced hepatocyte damage. But the detailed mechanism of Isosteviol inhibited lipid accumulation in hepatocyte is still not clear. According to the data of lipidomics we found that Isosteviol regulated the content of triglyceride in rat liver and could also inhibited the expression of key triglyceride synthesis enzymes, such as SCD1 and GPAT. Because of the inhibitive effect of Isosteviol on PKC-β expression and activity, we hypotheses that Isosteviol might decrease lipid especially triglyceride accumulation through PKC-β-SREBP1C-SCD1/GPAT pathway. We will use the methods such CRISPR-Cas9 gene knock out and PKC-β conditional knockout mice non-alcohol fatty liver disease model and lipidomics to find out the detailed mechanism of SREBP1C expression regulated by PKC-β, the regulation effect of SREBP1C on SCD1/GPAT expression and their function in lipid accumulation, and the effect of lipid content change after Isosteviol treatment on lipid metabolism and non-alcohol fatty liver disease. PKC-β-SREBP1C-SCD1/GPAT pathway also provides new targets for the therapy of non-alcohol fatty liver disease.

前期研究发现异甜菊醇抑制PKC-β活性及表达，通过PKC-β/p66Shc/ROS通路，降低氧化应激、缓解内质网应激及减少线粒体-内质网相互作用来保护非酒精性脂肪肝病，但是其抑制肝细胞内脂质沉积的机制仍不明确。肝脏脂质组学结果表明异甜菊醇还能改变细胞内甘油三脂组成成分，并抑制参与甘油三脂合成的关键酶SCD1和GPAT的表达。我们首次提出异甜菊醇通过抑制PKC-β-SREBP1C-SCD1/GPAT通路，改变肝细胞内甘油三脂的组成并减少细胞内脂质沉积。我们将应用CRISPR-Cas9技术敲除相关基因、使用条件性敲除PKC-β小鼠模型，色谱检测，脂质组学分析等方法，揭示PKC-β调控SREBP1C表达；SREBP1C调节SCD1、GPAT表达及功能在脂质沉积中的机制；探讨异甜菊醇引起的脂质，特别是甘油三脂组成成分变化对脂质代谢及非酒精性脂肪肝病的影响；为临床治疗提供了新的药物及信号通路靶标。

非酒精性脂肪肝病是一种典型的代谢性疾病（non -alcoholic fatty liver disease, NAFLD)），多发于胰岛素抵抗和肥胖的患者。NAFLD可进展成为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）、肝纤维化、肝硬化，严重威胁人类健康。目前尚无有效的临床治疗药物，本项目考察异甜菊醇对高脂饮食导致的实验动物NAFLD的治疗作用，并研究其在肝细胞内脂质沉积、活性氧生成、内质网应激等方面的分子机制，为开发临床治疗药物提供实验支持和理论依据。本项目发现异甜菊醇能够抑制高脂饮食导致的实验动物NAFLD，减少肝细胞损伤以及炎症细胞浸润，降低血清转氨酶水平，缓解血脂紊乱；离体实验中，异甜菊醇能够降低游离脂肪酸诱导的肝细胞脂质沉积以及肝细胞凋亡。通过构建选择性敲除肝实质细胞PKC-β小鼠、敲减肝细胞内PKC-β、p66Shc等基因或者使用PKC-β的抑制剂/激活剂等方法，我们发现异甜菊醇的作用机制同抑制PKC-β的活性及表达有关。通过减少PKC-β下游分子p66Shc的磷酸化及进入线粒体，抑制活性氧的生成；同时异甜菊醇也可以通过PKC-β影响SREBP1C的表达和进入细胞核，抑制参与脂质合成的FASN、GPAT、SCD1、DGAT以及ACC1的表达，减少脂质新生，降低肝细胞内脂滴的含量，减少脂质过氧化，拮抗脂质沉积导致的肝细胞凋亡；异甜菊醇也可以抑制脂质过多导致的内质网应激，减少线粒体与内质网间的相互作用。通过以上作用机理，阐明了异甜菊醇通过PKC-β-SREBP1C-SCD1/GPAT信号通路抑制过多的脂肪酸诱导的肝细胞内脂质沉积，进一步抑制肝细胞内氧化应激以及内质网应激，最终发挥保护肝细胞的作用。通过对异甜菊醇药效学的评价以及其作用机制的研究，我们为开发治疗NAFLD的药物提供了候选化合物以及新的作用靶点，为深入开展相关药物研究提供了实验和理论的支持。