奶牛乳腺细胞葡萄糖摄取机制及其对乳成分合成的影响研究

奶牛泌乳期间，乳腺需要大量的葡萄糖，其对葡萄糖的需求和利用是多方面的，葡萄糖供应量和吸收率是限制其泌乳潜力发挥的关键因素。鉴于目前反刍动物葡萄糖营养代谢机理及调控体系研究现状，本课题拟利用泌乳奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系，研究葡萄糖转运相关蛋白及其代谢关键酶对乳腺葡萄糖摄取的调控作用及对乳腺养分合成的影响机制，初步揭示乳腺葡萄糖摄取的细胞及分子机制，在此基础上结合奶牛饲养试验和活体取样技术进一步探明葡萄糖对乳腺各养分合成、分泌的影响及其有效利用率，定向调控乳成分。该研究有利于揭示葡萄糖供应模式与奶牛乳汁合成、分泌之间的关系，探讨乳腺细胞对葡萄糖的吸收利用机制，为构建奶牛泌乳需要的适宜葡萄糖营养模型和能氮平衡模式，定向调控乳成分提供理论依据，并为研究乳腺养分代谢规律提供研究平台。

葡萄糖是乳汁合成的主要前体物质之一，与乳产量和乳品质密切相关。本项目围绕奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖摄取的调控及其对乳成分合成的影响展开了以下研究：（1）泌乳奶牛乳腺上皮细胞模型建立及其功能检测：采用组织块培养法得到奶牛乳腺上皮细胞，在培养体系中添加了催乳素、胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白等成分，采用0.25%胰酶和0.15%胰酶加0.02%EDTA反复酶差消化法，得到较纯的乳腺上皮样细胞。通过上皮细胞特征性标志物-细胞角蛋白18免疫细胞化学鉴定和细胞生长曲线分析，证明培养得到的细胞是正常乳腺上皮细胞。通过细胞亚显微结构、乳脂形态观察、s1酪蛋白基因表达、酪蛋白Western-blot含量检测等方法检测乳腺细胞的泌乳功能。成功建立奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型；（2）泌乳相关激素对乳腺细胞主要葡萄糖转运载体基因表达的影响及相关信号通路研究：研究结果提示，GLUT1和GLUT8基因表达分别受不同泌乳相关激素的调控，胰岛素可能主要通过PI3K/PKC通路促进GLUT8表达和葡萄糖摄取；（3）单糖基质和葡萄糖浓度对乳腺细胞糖摄取的调控及其机理研究：研究结果提示，奶牛乳腺上皮细胞可以利用果糖，其转运和利用效率高于葡萄糖。葡萄糖浓度可能部分通过提高HKs酶活调控乳腺细胞葡萄糖摄取，而HK2在此过程中起重要作用；（4）葡萄糖浓度对乳腺细胞主要乳成分合成和葡萄糖代谢的影响：研究结果提示，增加葡萄糖供应可能增加了乳糖合成底物浓度，促进乳糖合成，促进葡萄糖酵解和磷酸戊糖途径的代谢，增加细胞能量产出，进而提高乳腺乳脂合成量。. 综上所述，本研究成功构建了奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型，利用此模型研究发现，奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖摄取受泌乳相关激素、单糖基质类型和浓度的影响。其中胰岛素在奶牛乳腺葡萄糖摄取中发挥重要作用，它可能通过PI3K/PKC通路影响GLUT8表达从而调控葡萄糖摄取；葡萄糖浓度对葡萄糖摄取的调控主要通过影响HKs活力而不是主要葡萄糖转运载体基因表达而实现；葡萄糖浓度可影响乳成分合成，增加葡萄糖供应可能通过调控乳腺葡萄糖代谢而促进主要乳成分如乳脂和乳糖的合成。