长链非编码RNA XIST和OIP5-AS通过miR-30b介导调控电压门控钠离子通道Nav1.3参与神经病理性疼痛的研究

The mechanism of neuropathic pain has been a difficult exploring point as well as a research topic, previous study mainly focus on functional protein expression level while the non-coding RNA mechanism on neuropathic pain remains unclear. Pilot study shows that variety non-coding RNAs change in neuropathic pain, up-regulation of long non-coding RNA XIST and OIP5-AS and down-regulation of miR-30b both closely associated with sodium ion channel 1.3 expression, therefore, based on rats SNI model (spinal nerve ligation model) ,in this study, we used in situ hybridization, qPCR, Western blot, Northern-blot ,CHIP(Chromatin Immunoprecipitation), siRNA, lentiviral packaging clone, ganglion microinjection, intrathecal injection, DRG cell culture, dual luciferase report, single-cell PCR, immunofluorescence staining, CPP(Conditioned Place Preference), electrophysiology etc experimental methods, to explore the mechanism of non-coding RNA involved in neuropathic pain, exploring mechanism of non-coding RNA participation of neuropathic pain, to develop a novel idea on neuropathic pain treatment.

神经病理性疼痛的机制一直是科学家探索的难点和研究的热点，既往的研究多集中在功能蛋白表达水平，而非编码RNA（Non-coding RNA）对于神经病理性疼痛的调控机制尚不清楚。前期预实验显示miR-30b的下调导致钠离子通道1.3的表达升高在病理性疼痛中发挥重要作用。然而miR-30b被调控机制不明。进一步预实验结果显示与miR-30b相关联的长链非编码RNA XIST和OIP5-AS表达上调，因此本研究以SNL神经病理痛模型为研究对象，利用原位杂交、qPCR、Western-blot、Northern-blot、SiRNA干扰、慢病毒包装克隆、神经节显微注射、鞘内置管给药、原代神经元细胞的培养、双荧光素酶报告基因、单细胞PCR、免疫荧光、CPP、电生理等实验方法，探索ncRNA参与慢性疼痛发生的机制，完善非编码RNA参与生物学调控，为治疗神经病理性疼痛开辟新思路。

神经病理性疼痛以自发痛、痛觉过敏和痛觉超敏为主要特征，是目前临床上尚难以攻克的治疗难点之一。在本项目中，我们对长链非编码RNA OIP-AS通过调控miR-30b-5p及其靶标电压门控钠离子通道在神经病理性疼痛的发生发展中的参与进行了研究。首先，我们通过RNA测序及分析，获得了神经病理性疼痛中差异表达的lncRNA及miRNA。随后，我们对主要差异表达的miRNA在神经病理性疼痛中的作用进行了验证。我们发现，背根神经节（Dorsal root ganglion, DRG）中miR-30b-5p表达减少导致钠离子通道Nav1.3和Nav1.6过表达，介导了神经损伤和化疗诱导的神经病理性疼痛的发生。通过鞘内注射miR-30b-5p类似物（agomir）可恢复miR-30b-5p的水平可抑制Nav1.3和Nav1.6的过表达，抑制DRG神经元的Nav电流水平和神经元兴奋性，缓解疼痛。接下来，在对miR-30b-5p表达变化的表观遗传调控机制的探索中，我们发现，在化疗诱导的神经病理性疼痛中，OIP5-AS表达显著升高，介导了miR-30b-5p表达减少，进而导致其下游Nav1.6蛋白表达显著升高，DRG神经元上Nav电流显著增大，神经元兴奋性显著增强，动物出现痛觉过敏。特异性敲除DRG中OIP5-AS可恢复miR-30b-5p的表达，抑制Nav1.6表达，恢复DRG神经元的Nav电流水平和神经元兴奋性，缓解奥沙利铂诱导的机械痛敏和冷痛觉过敏。综上，我们的研究发现，在神经病理性疼痛过程中，OIP5-AS升高介导的miR-30b-5p表达降低导致了DRG中电压敏感钠离子通道Nav1.3和Nav1.6过表达，导致DRG神经元过度兴奋，进而介导神经病理性疼痛的形成。同时，我们的结果也提示，以OIP5-AS或miR-30b-5p为靶点可能成为治疗神经病理性疼痛的有效手段之一，这有待在未来进行进一步研究、验证与开发。