MLK3-MKK7-JNK3信号模块与HO-1的作用位点在缺血性脑中风中的作用机制

The activation of cysteinyl aspartate-specific protease-3 (Caspase-3) induced by ischemia and reperfusion could cause severe neuron injury and disorder of learning and memory. During the research of the previous project, it was indicated that brain ischemia could facilitate heme oxygenase -1 (HO-1) to combine with MLK3-MKK7-JNK3 signal module and increase the activation of Caspase-3. However, which protein of JIP1, MLK3, MKK7 or JNK3 can combine with HO-1, and where are interacting sites between them, are still unclear. These interacting sites may become new drug targets if they are found in the future. In this project, mammalian two-hybrid system will be used to sieve the "interest protein" which can combine with HO-1 directly from JIP1, MLK3, MKK7 and JNK3; GST pull-down, immunoprecipitation and confocal laser scanning microscope (CLSM) will be used to validate the above experimental results; The sites mutagenesis of HO-1 and "interest protein" will be prepared to sieve and validate the interacting sites between HO-1 and "interest protein" using the above technologies. These interacting sites will be mutated to explore the effects and relative mechanisms of them on the regulating JNK3 /Caspase-3 signaling pathway, neuron apoptosis, learning and memory after brain ischemia. This project will provide new drug targets and experimental evidences for the therapy of the ischemic stroke.

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的激活会导致严重的神经元损伤和学习记忆障碍。前一项目的研究表明：脑缺血可促使血红素加氧酶-1（HO-1）与MLK3-MKK7-JNK3信号模块结合，从而激活Caspase-3。可是，HO-1是与该模块的支架蛋白JIP1直接作用，还是与MLK3、MKK7或JNK3作用，及具体作用位点，尚不清楚。该位点若能探明，则可能成为新的药物靶点。 本项目拟采用哺乳动物细胞双杂交，从JIP1、MLK3、MKK7和JNK3中筛选与HO-1直接作用的"目的蛋白"，以GST pull-down、免疫沉淀和激光共聚焦验证之；分别构建HO-1和"目的蛋白"的位点突变体，再以上述技术筛选并验证两者之间的作用位点；突变该位点，探索该位点在脑缺血后JNK3 /Caspase-3通路的调控、神经元凋亡和学习记忆中的作用及机制。本项目可为该病的治疗提供新的药物靶点和实验依据。

缺血性脑中风严重威胁人类的健康，常会引起缺血部位的神经元损伤，从而导致相应的功能缺失或下降。缺血可激活海马神经元中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3），导致细胞凋亡和学习记忆障碍。前一项目的研究表明：脑缺血能促使血红素加氧酶-1（HO-1）与MLK3-MKK7-JNK3信号模块结合，从而激活Caspase-3。可是，HO-1是与该模块的支架蛋白JIP1直接作用，还是与MLK3、MKK7或JNK3作用，以及具体作用位点，尚不清楚。该位点若能探明，可能成为新的药物靶点。本项目的研究内容和结果主要有：（1）筛选目的蛋白。研究发现HO-1与JIP1、MLK3、MKK7和JNK3中皆可相互作用；结果提示与HO-1相互作用的目的蛋白并非单一，而是通过与该模块中的多个蛋白相互作用而发挥其功能。（2）筛选作用位点。通过查询NCBI蛋白质信息数据库，结合实验结果发现HO-1的25号的组氨酸和143号的甘氨酸是重要的作用位点，在HO-1抑制细胞凋亡中起关键作用。此两个位点有望成为研发治疗该病的药物的新靶点。（3）作用和机制的研究。进一步阐明了HO-1在脑缺血后JNK3信号通路的调控、神经元凋亡和学习记忆中的作用和机制。研究发现，脑缺血后HO-1可通过干预以JIP1为支架蛋白的MLK3-MKK7-JNK3信号模块中各蛋白的相互作用，抑制JNK3及其下游促凋亡信号分子发挥神经保护作用，减轻学习记忆障碍。总之，以上结果表明：HO-1可与MLK3、MKK7和JNK3及其支架蛋白JIP1相互作用，保护神经细胞；HO-1的25号的组氨酸和143号的甘氨酸是其发挥神经保护作用的关键位点；HO-1能够通过干预MLK3-MKK7-JNK3信号模块的组装抑制JNK3及其下游促凋亡信号分子，从而抑制神经元凋亡，改善学习记忆能力。本项目为缺血性脑中风的治疗提供了新的药物靶点和实验依据。