红细胞偶联MSC来源外泌体抑制GVHD的分子影像学研究

The high incidence of graft-versus-host disease (GVHD) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is an important cause of death. Mesenchymal stem cell exosomes (MSC-EVs), as a new type of cell therapy, play an important role in immune regulation, anti-inflammation, tissue and organ repair. Previous studies showed that majority MSC-EVs assembled in liver and spleen after infusion, and they were recognized and metabolized by macrophages within a short time. Therefore, to find a biological carrier which can effectively prolong the half-life of MSC-EVs is extremely urgent. Red blood cells, as a new drug-delivery system, are the most abundant and longest-lived cells in blood. However, whether MSC-EVs can improve the therapeutic effect of GVHD by conjugated with red blood cells, the dynamic changes of its migration and localization in vivo, and the interactions with T cells still remained to be interpreted. To address this key issue, we will take an advantage of multi-mode imaging in the application of immune and stem cells tracking to monitor localization and half-life of RBC-MSC-EVs in vivo. Based on multi-modal imaging system, our study can also be expected to be a platform for the preclinical evaluation of RBC-MSC-EVs application in the treatment and protection of GVHD.

异基因造血干细胞移植术后高发的移植物抗宿主（GVHD）是造成患者死亡的重要原因。间充质干细胞外泌体（MSC-EVs）作为一类新兴的细胞治疗手段，能够有效防治GVHD的发生发展。前期研究结果显示，MSC-EVs输注后短时间内即被肝脾组织巨噬细胞识别代谢。因此，寻找一类能够有效延长MSC-EVs半衰期的药物载体十分迫切。移植患者术后往往需要大规模输血，研究已证实红细胞作为一类新型生物载体在延长药物半衰期方面优势明显。MSC-EVs是否可以通过与红细胞偶联延长其半衰期以提高GVHD治疗效果，其在体内迁移、定位的动态变化，以及与T细胞相互作用的具体机制均有待进一步阐述。本项研究中，拟发挥多模式分子成像技术在细胞标记方面的优势，从整体水平监测RBC-MSC-EVs在体内各器官的具体定位及停留时间，进而阐明RBC-MSC-EVs诱导免疫耐受的具体分子机制，为临床异基因移植后治疗GVHD提供实验依据。

异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病（GVHD）的高发是引发患者死亡的重要原因，间充质干细胞（MSC）输注可通过抑制供者T淋巴细胞的过度活化而降低GVHD的发生率。间充质干细胞外泌体（MSC-EVs）作为一类新兴的细胞治疗手段，能够在免疫调节，抑制炎症，修复损伤的组织器官中发挥重要作用。前期研究结果显示，MSC-EVs输注后短时间内即通过肝脾组织被代谢。因此，寻找一类能够有效延长MSC-EVs半衰期的生物载体十分迫切。本项研究创造性的提出了以红细胞膜包裹MSC-EVs以逃避体内巨噬细胞额的吞噬与清除。利用分子影像学手段，重点探究了红细胞膜包裹的MSC-EVs（RMSC-EVs）抑制GVHD的分子机制。. 研究结果证实可以通过机械挤压法制备RMSC-EVs，经透射电镜观察可见明显的双层膜结构，超高分辨共聚焦结果分析也显示红细胞膜位于MSC-EVs外侧，其余电位、粒径、western blot及SDS-PAGE的检测结果均支持RMSC-EVs制备成功。进一步测定了RMSC-EVs在血清（体内工作环境）中的稳定性，结果显示在7日的观察期内，RMSC-EVs粒径变化在10%之内，未发生明显碎裂。ELISA检测RMSC-EVs分泌的HGF、IL-10、PGE2及IDO的细胞因子水平，显示红细胞膜对MSC-EVs的细胞因子释放起控释作用，有效延长其释放细胞因子时间；同时淋巴细胞抑制实验结果也证实RMSC-EVs具有与MSC-EVs相当的抑制T淋巴细胞增殖活化的效果。基于Fluc+转基因小鼠建立可视化GVHD动物模型，经尾静脉输注的RMSC-EVs在体内各器官的半衰期得到显著改善，且在肺脏，肝脏，脾脏，睾丸等部位均匀分布。综上所述，RMSC-EVs能够通过延长MSC-EVs的体内半衰期，进一步提高其在GVHD治疗中的疗效。本研究充分发挥了多模式分子成像技术在间充质干细胞标记方面的优势，从整体水平同时监测T细胞的增殖、活化和分布，将为RMSC-EVs治疗GVHD提供临床前评价数据。