肿瘤相关抗原GCF2在肝癌发生中的作用机理研究

目前研究发现GCF2（GC Binding Factor 2）是一种转录抑制因子，通过抑制富含GC启动子基因的转录，参与细胞增殖和凋亡等进程，与包括肿瘤的多种疾病的发生有密切关系，但具体作用机制不明确。本课题组前期采用重组克隆表达抗原的血清学技术发现肝癌cDNA文库有三个与GCF2蛋白同源的克隆，血清学初筛结果显示GCF2抗体在大多数肝癌患者的血清中出现，也在部分乙肝、淋巴瘤、肾癌和黑色素瘤患者的血清中出现，推测其可能是一个广谱的肿瘤相关抗原，但是其在临床诊断的价值还有待验证。因此本项目的研究内容是⑴重组表达GCF2蛋白，采用ELISA的方法检测抗GCF2抗体在多种肿瘤和健康人血清中的表达水平，探索GCF2在肿瘤尤其是肝癌中的临床应用价值；⑵用染色质免疫共沉淀测序技术，在全基因组范围寻找GCF2在肝癌细胞内抑制的靶标，同时用凝胶阻滞和siRNA技术探索GCF2蛋白参与肝癌发生发展的作用机制

GC结合因子2（GC binding Factor 2 ，GCF2）是一种转录抑制因子，抑制富含GC启动子基因转录。本课题组前期研究发现GCF2抗体在肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）患者血清出现，而在正常人血清中未见。但是GCF2在HCC临床诊断价值以及其与肝癌发生的关系尚未见报道。因此本研究：⑴原核表达并纯化了6His×GCF2融合蛋白，为检测GCF2相应抗体在肿瘤患者血清中阳性率打下基础。⑵免疫组化j技术发现GCF2蛋白在HCC组织、对应癌旁组织及正常肝组织中均定位于细胞核和胞质, 且在正常肝组织和癌旁肝组织中的表达均显著高于HCC组织（P<0.05）；GCF2在HCC组织中的阳性表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、临床分期、肝硬化背景、AFP及HBsAg等情况差异无统计学意义的相关性(P>0.05)。⑶Western Blot和免疫细胞化学发现GCF2蛋白在肝癌细胞株BEL-7404、HepG2、SMMC-7721、QGY-7703中和成人正常肝细胞株HL-7702的胞核及胞质中均有表达，且在以上5种肝癌细胞株内表达均显著高于正常肝细胞株，其中在BEL-7404中相对表达量最高（P<0.05）。⑷siRNA沉默肝癌细胞株HepG2内GCF2表达后，HepG2的细胞增殖受到抑制，细胞周期阻滞于S期和G2期，细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。⑸本研究采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP )联合芯片(chip)技术筛选GCF2调控靶基因，在覆盖人类18028个基因启动子的基因芯片中，共筛选出1375个候选靶基因；然后采用GO聚类分析发现与上述细胞生物学行为相关的候选基因中有161个与细胞增殖有关，97个与细胞周期有关，134个与细胞凋亡有关。⑹通过定量或者半定量RT-PCR和western blot验证GCF2影响细胞生长/凋亡通路关键的四个靶基因CCND1、 TNFAIP3、CDKN1B和MAPK1，结果提示，siRNA沉默GCF2表达前后，MAPK1的表达改变显著（P<0.05），而CCND1、 TNFAIP3、CDKN1B表达无显著改变。目前正在对MAPK1涉及的信号通路进行探索。