大承气汤介导受体相关蛋白3抑制重症急性胰腺炎程序性坏死的分子机制

Necrosis is the major type of pancreatic acinar cell death in severe acute pancreatitis (SAP). Programmed cell necrosis, necroptosis was plays an important role in SAP. Reportedly, RIP3 is a potential target for effectively regulating SAP. Purging prescription Dachengqi Decoction could ameliorate the severity of SAP by reducing acinar cell necrosis. However, the biological mechanism governing its action is remain unclear. Previously, we found that Dachengqi Decoction prevent SAP necroptosis though inhibiting the expression of RIP3 by a caspase 8 independent manner. Based on our previous study, we will perform the following two studies: Reveal the pharmacological effect of Dachengqi Decoction on RIP3 mediated necroptosis in SAP. (2) Clarify the mechanism of RIP3 on Dachengqi Decoction ameliorated the acinar cell necroptosis during SAP. This research will reveal the molecular mechanism of the Dachengqi Decoction inhibiting necroptosis in SAP.

坏死是重症急性胰腺炎（SAP）中胰腺腺泡细胞的主要死亡方式，而程序性坏死作为一种可调控的坏死方式在SAP中发挥着重要的作用。研究发现通过调控程序性坏死通路中受体相互作用蛋白3（RIP3），可以减少腺泡细胞坏死，减轻SAP病情。“通里攻下”方剂大承气汤可通过抑制胰腺腺泡细胞坏死进而治疗SAP。本课题组前期研究发现，大承气汤能够抑制SAP发生过程中RIP3蛋白的上调，同时，在泛Caspase抑制剂zVAD条件下，同样能够下调RIP3的蛋白表达。据此我们认为大承气汤通过Caspase非依赖程序性坏死途径是治疗SAP的主要作用机制之一。基于这个假设，本课题旨在于以体内外SAP模型，RIP3基因突变、缺失细胞及动物为研究对象，阐明大承气汤通过抑制SAP程序性坏死过程中RIP3的分子机制。该研究成果对于揭示大承气汤抑制SAP程序性坏死的分子机制，明确大承气汤治疗SAP的重要靶点有着重要的意义。

目的：明确大承气汤通过调控程序性坏死通路中受体蛋白3（RIP3）减轻重症急性胰腺炎（SAP）病情的具体机制。.方法：. 1.制备SAP胰腺腺泡细胞损伤模型比较不同组别中细胞凋亡率，炎症因子、Bax、MLKL、RIP1及RIP3 mRNA表达。明确大承气汤对SAP中RIP3的调控作用。.2.构建C57BL/6小鼠SAP模型。比较不同组别中的胰腺病理情况，检测血清淀粉酶、炎症因子、Bax、MLKL、RIP1及RIP3 mRNA表达。并通过免疫共沉淀观察大承气汤对RIP1/RIP3坏死体复合物的作用。阐明大承气汤在SAP小鼠模型中对RIP3的调控作用。.3.构建RIP3基因敲除小鼠SAP模型。比较不同组别中MLKL、AMS、Trypsin、ROS的表达和凋亡水平。明确大承气汤是否通过调控RIP3来抑制sap的程序性坏死。.4.基因芯片检测不同组别中RIP3蛋白表达情况，明确大承气汤对RIP3的调控作用。.结果：.1.在细胞实验中，大承气汤+SAP组的炎性因子和细胞凋亡率较SAP组明显下降，RIP3 mRNA和MLKL mRNA表达降低，而RIP1 mRNA的表达无明显差异，提示大承气汤通过抑制SAP模型中的RIP3来改善胰腺损伤； .2.在C57BL/6小鼠中，SAP+大承气汤组中的炎性因子和血清淀粉酶较SAP组明显降低，说明大承气汤改善小鼠SAP模型中胰腺的炎症反应。SAP+大承气汤组中血清中RIP3和MLKL表达明显降低,而RIP1较SAP组无明显差异。说明RIP3在SAP的发病中起作用，进一步验证了大承气汤可能通过下调RIP3水平改善SAP。.3.在RIP3基因敲除小鼠SAP模型中，SAP组、SAP+大承气汤组中的MLKL、AMS、Trypsin表达降低，ROS表达显著升高，caspase3、caspase8表达降低。由此说明大承气汤可以减少RIP3基因敲除小鼠SAP模型中胰腺的细胞凋亡，改善小鼠SAP炎症反应。.4.基因芯片聚类热图结果显示，与空白组相比，SAP模型组中RIP3 mRNA为高表达蛋白,而SAP+大承气汤组中RIP3蛋白低表达，两组间差异明显。由此进一步论证了大承气汤通过下调RIP3表达抑制SAP程序性坏死。.结论：RIP3在SAP的发病中起到重要作用，大承气汤可以通过下调RIP3抑制SAP程序性坏死，改善SAP。