有关线粒体DNA遗传方式和相关分子机制研究

Keeping homogeneous mitochondria DNA (mtDNA) is very important for organisms, because mixed mtDNAs may produce adverse physiological effects. Maternal mitochondrial inheritance, as one of the most important mechanisms to keep homogeneous mtDNA working at the beginning of life has great significance. However, the exact mechanisms for maternal mitochondrial inheritance are far from clear. Recently, it has been speculated that autophagy may be an evolutionary conserved mechanism for paternal mitochondrial elimination. However, by utilizing two transgenic mouse strains, we found that autophagy did not participate in the post-fertilization elimination of sperm mitochondria in mice. Maternal inheritance of mtDNA is not an active process of sperm mitochondrial and mtDNA elimination achieved through autophagy in early embryos, but it may be a passive process, due to pre-fertilization sperm mtDNA elimination and uneven mitochondrial distribution in embryos. However, the exact molecular mechanisms of how to pre-eliminate sperm mtDNA before fertilization and protect sperm mitochondria from being degraded by autophagy are not clear. In this study, we will utilize early embryi siRNA microinjection, nuclease and USP30 gene knock-out, live cell imaging and other technologies to investigate the mechanism of maternal and paternal inheritance of mtDNA.

mtDNA通常是通过母系遗传的，但有关机制并不清楚。我们的前期工作表明，小鼠mtDNA的遗传方式以母系遗传为主，但也有部分双系遗传的现象。形成mtDNA母系遗传的主要机制包括：1)受精前精子mtDNA被清除；2）受精后，精子线粒体不均匀分布，致使有的精子线粒体被胎盘所继承而没有遗传给后代。我们的前期工作也表明，尽管大部分精子在受精前已经清除了其mtDNA，但是也有部分精子保留了mtDNA，当这部分精子参与受精时，其mtDNA则有可能会遗传给后代，形成mtDNA的双系遗传。但是，有关受精前，mtDNA清除的分子机制（母系遗传），和受精后精子线粒体为什么没有被自噬所清除的分子机制（父系遗传）并不清楚。本研究拟通过核酸酶和USP30基因敲除、早期胚胎siRNA显微注射等技术，进一步研究小鼠线粒体母系和父系遗传的分子机制，为预防和治疗线粒体疾病提供思路。

线粒体DNA（mtDNA）属于母系遗传，mtDNA突变会造成严重的线粒体疾病。目前，利用线粒体置换技术对患有mtDNA突变的胚胎进行线粒体置换是最有效的阻断mtDNA疾病遗传的方法，利用线粒体置换技术所诞生的婴儿即为三亲婴儿，包括核基因组父母和mtDNA母亲。由于线粒体置换技术本质上还是属于核移植，在移植的过程中难免会携带有原来的突变mtDNA至新的胚胎中，并继续影响新个体的健康情况，这也是影响线粒体置换技术进入临床使用的重要因素。.本课题研究了利用线粒体自噬清除核移植过程中突变mtDNA的可行性。设计了一个全新的方案对核移植过程中核供体的线粒体进行标记，被标记的线粒体在新胚胎发育过程中能被自噬所识别并降解，从而达到完全清除异常线粒体DNA的目的。研究过程中我们发现：.1..膜电位抑制剂诱导的线粒体自噬导致细胞凋亡。用20 μM的CCCP处理细胞后发现CCCP诱导的线粒体自噬不明显，自噬发生后细胞核出现凝缩，细胞逐渐凋亡，并且处于分裂期的细胞无法继续分裂。.2..CISD1-RFP-SQSTM1和CISD1-RFP-MAP1LC3B-binding诱导的线粒体自噬相对专一，且不容易诱导细胞凋亡。通过脂质体转染的方式发现，SQSTM1与LC3共定位，可形成自噬体并进入溶酶体，随着时间的推移，线粒体数目明显减少。 .3..异位表达SQSTM1和MAP1LC3B-binding是安全有效的清除线粒体的方法。对转染成功的细胞进行线粒体膜电位及活性氧检测发现，SQSTM1对线粒体膜电位及活性氧影响不大；MAP1LC3B-binding使线粒体膜电位基本丢失，活性氧普遍偏低。转染72 h后，两者的细胞核无明显变化，并且细胞可见处于分裂状态。.4..被CISD1-RFP-MAP1LC3B-binding所标记的核供体的线粒体被完全降解，且经显微注射mRNA后的小鼠胚胎发育正常，并能生出健康的后代与对照相比我明显差异。.本课题在细胞层次和小鼠胚胎层次均对利用线粒体自噬清除异常线粒体的方案进行了有效性和安全性的验证，为核移植过程如何清除原有的线粒体提供了有效的方案，必将有助于推动核移植更广阔的应用，包括人类的辅助生殖技术和动物克隆。