构建基于温度控制蛋白质捕捉和释放在线固相萃取-毛细管电泳/毛细管电色谱用于蛋白质浓缩和分析研究

Proteins are important biomacromolecules in life science. They are material basis for organisms to fulfill their functions. Therefore, high-sensitivity analysis and detection of proteins have attracted great attention for decades. In order to improve relatively low detection sensitivity of capillary electrophoresis due to small sample volume and short optical length for on-line detection, we plan to design a novel temperature responsive capture and release of proteins on-capillary solid phase extraction-capillary electrophoresis for enrichment and analysis of proteins. A monolayer of poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) is to be immobilized on silica monolithic column. This polymer exhibits hydrophilicity below critical solution temperature and hydrophobicity above critical solution temperature. Accordingly, proteins could be captured on the monolayer of PNIPAM above the critical solution temperature and could be released below the critical solution temperature. By optimizing solid phase extraction column length, porosity of silica monolithic column and increasing PNIPAM bonding density as well as combining solid phase extraction and field amplified sample stacking technique, detection sensitivity of proteins could be greatly improved on this system. In addition, we will construct aforementioned solid phase extraction column-capillary electrochromatography for efficient enrichment and analysis of proteins. Solid phase extraction, chromatographic zone-sharpening effect and field amplified sample stacking are to be utilized to improve protein detection sensitivity. Based on the above research, we aim to develop novel and efficient methods for protein concentration and separation.

蛋白质是生命科学中一类重要的生物大分子，是生物体实现其功能的物质基础，因此蛋白质的高灵敏度检测和分析一直是研究热点。针对毛细管电泳检测灵敏度因检测光程短而较低的问题，拟构建新型基于温度控制蛋白质捕捉和释放的在线固相萃取-毛细管电泳体系，用于蛋白质的富集和分析。首先在柱上固相萃取硅胶整体柱上键合单层聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM），利用该聚合物在高于临界溶解温度呈疏水性和在低于临界溶解温度呈亲水性的特性进行蛋白质的捕捉和释放。通过优化在线固相萃取柱长度、硅胶整体柱孔隙率以及提高PNIPAM键合密度，并将固相萃取和场放大效应结合，实现在柱上固相萃取-毛细管电泳体系上蛋白质的高效富集和分离。此外我们还将构建上述在线固相萃取-毛细管电色谱体系，将固相萃取、场放大效应和色谱区带压缩效应相结合，提高蛋白质的检测灵敏度。通过上述的研究，我们旨在发展新型高效蛋白质浓缩和分离方法。

蛋白质是生物体内一类重要的大分子，是生物实现其各种生物功能的物质基础。无论是细胞内还是器官内，蛋白质的丰度通常相差几个数量级，高丰度的蛋白质常常将低丰度的蛋白质掩盖，致使一些低丰度的蛋白质难以检测到。目前用于蛋白质分析的首要手段之一是毛细管电泳，由于毛细管电泳的检测光程过短，又进一步降低了蛋白质的检测灵敏度度。为了解决上述问题，我们开展了如何下的研究。. 分别采用两种双官能团试剂实现了PNIPAM在硅羟基表面的高密度键合，PNIPAM在最低临界溶解温度以上及以下显示出良好疏水和亲水的转变，进而展现出脱附与吸附蛋白质的能力，并在温敏材料的表面进行了蛋白质竞争吸附的研究，结果表明PNIPAM与蛋白质溶液接触短时，优先吸附的是小蛋白质，但接触时间足够长时，因大蛋白质与PNIPAM作用位点较小蛋白质更多，大蛋白质最终取代之前吸附在PNIPAM表面的小蛋白质。. 在线固相萃取的比表面积及孔隙率取决于硅胶整体柱的性质，硅胶整体柱的孔径大小以及分布决定其柱效。高柱效代表了对孔径、孔径分布以及孔隙率的控制。我们通过对制备整体柱条件的优化以及对文献方法的改进，制备了柱效高达43万塔板数/米的硅胶整体柱，实现了4种丁基苯位置异构体的分离。范迪姆特方程表明流速增加塔板高度随流速的增加而降低，非常适合快速分析。. 构建了构建基于温敏材料捕捉或释放蛋白质在线固相萃取-毛细管电泳/电色谱体系。. 同时我们也开展了基于差速毛细管电泳选择性富集低丰度蛋白质的研究，成功富集了牛血清白蛋白与溶菌酶中低丰度的溶菌酶。采用大鼠血清为对象检测了3种高电荷质比的低丰度蛋白质，验证了该方法对实际复杂生物样品的可行性。. 与此同时，为了解决聚合物整体柱通透性差的问题，我们通过降低单体在反应混合物中的比例，制备出高通透性、高柱效的聚合物整体柱，其柱效高达38万塔板数/米，远高于文献报道结果，并且该聚合物在分离碱性化合物时，在没有胺改性剂且中性条件下碱性化合物峰型对称。. 为了提高毛细管电色谱运行稳定性，分别采用物理法、光解法与物理法制备了具有改进柱型的毛细管电色谱整体柱，即检测窗口前后均具有填料，而检测窗口位置无填料。