食管癌中靶向调控fascin基因的 miRNA的鉴定及其表达调控机制

我们以往的系列实验结果表明，fascin基因在食管癌中异常过表达，与癌细胞增殖、侵袭移动及不良预后密切相关，是一个重要新食管癌相关基因，但过表达调控机制不明。最近，我们通过分析配对食管癌样本miRNA表达谱，获得了40个在食管癌组织中显著下调的miRNA。通过综合运用生物信息学分析和报告基因检测等手段发现，其中的miR145、miR143和miR200b等五种miRNA能靶向调控fascin表达。基于此，本项目拟首先采用miRNA转染、fascin表达检测以及细胞功能分析等手段，从中鉴定出靶向作用于fascin的最有效的miRNA；然后应用基因克隆、定点突变和染色质免疫共沉淀等方法，找出调控该miRNA转录的关键抑制因子；最后，回归到食管癌临床组织样本，分析fascin，miRNA及miRNA转录调控抑制因子三者之间的功效因果关系，在转录后调控层面揭示fascin在食管癌中过表达分子机制。

fascin是一种重要的食管癌相关基因，它在食管癌中的过表达还涉及到转录后调控层面。（一）本项目应用三种实验策略对食管癌中靶向调控fascin 的miRNA 进行全面鉴定：1. 通过食管癌miRNA 表达谱获得差异表达miRNA，预测其中5个下调miRNA（miR-133b、miR-143、miR-145、miR-200b 及miR-338-3p）可靶向调控fascin；在食管癌细胞系中分别瞬时转染五种miRNA，对fascin 3′UTR 报告基因活性均有明显的抑制作用，fascin蛋白水平呈不同程度的降低。构建miRNA 的食管癌稳定表达细胞系，fascin 蛋白水平也显示下调。2.从fascin 低表达的SW480 细胞提取胞浆复合物，经过两轮反转录，获得5′-miRNA-cDNA-3′分子；加上接头序列，利用fascin 基因3′UTR 特异引物和接头序列进行PCR 扩增并测序。序列比对分析发现miR-1537 与fascin 3′UTR 存在一定的互补性。将miR-1537 瞬时转染KYSE180，fascin 蛋白水平明显下降。3. 对含有610 个miRNA的表达库，在293T 细胞中进行双荧光素酶报告基因筛选，共获得53 个候选miRNA。对其中15 个候选miRNA 在食管癌细胞系中进行验证， 多个miRNA显著降低fascin 报告基因的活性并降低fascin 蛋白水平。将miR-671 和let-7a 过表达，均能明显抑制食管癌细胞的侵袭和移动能力。（二）QRT-PCR分析靶向调控fascin的miR-143，miR-145和let-7a在多数食管癌临床样本及细胞系表达显著下调，miR-143和miR-145的表达水平与肿瘤细胞的侵润深度相关，let-7a的表达水平与食管癌的生存时间相关。（三）生物信息学与免疫组化分析结果提示在食管癌中EGF可能通过下游转录因子SP1的调控作用，在促使fascin过表达同时，在另一方面抑制了对fascin进行负调控的miRNA的表达。（四）利用生物信息学的超几何分布检验对本项目的差异表达miRNA进行miRNA-miRNA互作分析,靶向调控fascin的miR-133a，miR-143及miR-145存在互作。miR-200b除了调控fascin外，还靶向细胞骨架结合蛋白Kindlin-2抑制食管癌细胞的侵袭。