磁响应修饰单细胞在MFAB反应器中连续转化甘油制备罗伊氏素的应用基础研究

In the project, a novel individual cell immobilization method is proposed, which is cell modified with magnetic nanoparticles (MNP) and retained in magnetic field aided bioreactor (MFAB), to resolve the cell recycling problems of glycerol biotransformation for prodution of 3-hydroxypropionealdehyde by Lactobacillus reuteri. The aim of the research is to study the fundamental theory of the individual cell immobilization method used in biotransformation. Firstly, the interaction mechanism between MNP and cell is studied to reveal the general method of magnetic modifying cell and optimize the preparation conditions of MNP modified cell (MNP@cell). Secondly, the MFAB is established to explore the effects of the operation conditions, the system conditions and the structure conditions on the aggregation, the motion, the distribution and the fluidization of the MNP@cell, to elucidate the correlation between fluid structure and interface structure, and to determine the steady-state operating range. Finally, the new cell immbilization method is used in bioconversion of glycerol by L. reuteri. The time-spatial distribution of the MNP@cell, the key enzymes, the substrate and the product in MFAB is investigated. The mass balance equation and the mass transfer-bioreaction kinetics are modeled to ascertain the synergetic mechanism among the cell interception, the bioconversion, the mass transfer and the MNP@cell reactivation in MFAB. The results of the project will provide the theoretical basis of the individual cell immobilization method for its further application in more biotransformation process.

本项目针对罗伊氏乳杆菌转化甘油制备罗伊氏素过程中细胞难以重复利用的关键问题，提出采用磁性纳米粒子（MNP）直接修饰细胞，并在磁场辅助反应器（MFAB）中实现单细胞固定化的新方法，旨在研究新型的单细胞固定化技术用于生物转化过程的基础问题。首先研究MNP与细胞相互作用机理，揭示细胞磁修饰的通用方法，优化磁修饰单细胞的制备条件；其次构建MFAB，研究MFAB的操作条件、系统条件和设备条件对磁修饰细胞团聚、运动、分布、流态化的影响，阐明流体结构/界面结构之间的关联，获得稳态操作范围；最后将该固定化技术用于罗伊氏乳杆菌转化甘油工艺，研究活细胞、关键酶活、底物、产物在反应器中的时空分布规律，建立稳态平恒方程和传质-反应动力学方程，探明磁修饰细胞在MFAB中细胞截留/生物转化/传递/再激活过程的协同机制。本课题的开展将为单细胞固定化技术在生物转化过程中的应用提供理论依据。

细胞固定化是全细胞生物催化转化过程中实现细胞重复利用的重要方法。传统的活细胞固定化方法多采用细胞包埋的方法，但包埋细胞的微囊内扩散效应往往成为整个催化反应过程中的限制步骤。此外，传统细胞固定化过程复杂，固定化过程中细胞活性易受损伤。本项目提出采用磁性纳米粒子直接与细胞表面相互作用，实现对单个细胞的磁修饰，进而在磁场作用下实现对细胞的限域固定化。在此基础上，以罗伊氏乳杆菌转化甘油生产3-HPA过程为主要研究对象，研究了磁修饰罗伊氏乳杆菌在磁辅助固定床反应器中的催化转化特性。本项目主要研究了（1）不同尺寸磁性纳米粒子制备、包覆、表面修饰的方法，最后选择了10nm羧基磁性纳米粒子用于修饰模型细胞大肠杆菌、酵母和罗伊氏乳杆菌。结果表明，细胞表面的分子特性和电荷特性对磁性纳米粒子与细胞的相互作用影响巨大，在细胞表面和磁性粒子等电点之间时作用迅速。（2）设计了磁固定床反应器，考察了螺线圈电流、发酵液流速、床层孔隙率、MRc/p的对MNP@Cell截留的影响。结果表明，螺线圈电流为3.0 A，发酵液流速为9 mL/min，床层空隙率为0.88，MRc/p=1.5的条件下，磁修饰细胞截留效果较佳。（3）在磁固定床反应器中考察了甘油浓度、循环倍率、转化pH、转化-活化-转化过程中活化条件对磁修饰L. reuteri转化甘油生成3-HPA的影响。结果表明，在甘油浓度为240 mM，在循环倍率为10/h，pH 7.0的条件下， 2 h后3-HPA/甘油摩尔转化率为75.1%。对转化1 h后的细胞采用活化培养基（10 g/L葡萄糖、20 g/L酵母膏、pH7.0）再激活，转化率可达对应初次转化水平的75%以上。本项目的研究表明，磁性纳米粒子直接修饰单个细胞是可行的，在磁辅助反应器中实现细胞的固定化和重复利用方便快捷，但其在更大尺寸磁反应器中的应用尚有待进一步验证。