局麻药致孕鼠神经损伤中ROS爆发性形成及其作用靶点的研究

研究报道局麻药(LA)可抑制线粒体呼吸链和损伤线粒体膜,导致细胞能量代谢障碍,从而引起活性氧簇（ROS）爆发并导致细胞损伤。ROS爆发可能与AMPK（AMP激活的蛋白酶）持续激活有关，该损伤可被Clˉ转运体阻断剂DIDS抑制，本研究拟从线粒体角度，结合AMPK、Clˉ转运等因素深入探讨LA引起ROS爆发的触发因素和作用靶点。采用SH-SY5Y细胞株，运用基因转染/共转染技术、RNAi技术上调和沉默AMPKα2、VDAC1基因，检测LA损伤细胞时ROS的含量、线粒体mPTP开放情况、Clˉ浓度等指标，研究LA是否触发RIRR机制及其与氯离子动态变化的关系，以及ROS爆发的作用靶点及其与细胞损伤和凋亡的关系。最后构建AMPKα2 shRNA、VDAC１shRNA腺病毒载体，观测AMPKα2 蛋白以及VDAC１蛋白低表达孕鼠模型对LA损伤的反应，为解决妊娠中LA神经毒性的防治提供理论依据。

本项目对局麻药所致神经组织损伤时ROS爆发性形成的触发因素与作用靶点进行研究。我们成功构建pEGFP AMPKα和sh AMPKα重组质粒；并将质粒pGPU6/GFP / Neo-shRNA AMPKα2和pEGFP-N1- AMPKα2转染SH-SY5Y细胞株，建立SH-SY5Y sh AMPKα和pEGFP AMPKα细胞株。转染重组质粒的SH-SY5Y细胞经布比卡因和罗哌卡因处理后，我们发现细胞内AMPKα2过表达可促进布比卡因和罗哌卡因诱导细胞内ROS大量增多并导致细胞凋亡，而下调AMPKα2表达可抑制布比卡因和罗哌卡因诱导细胞内ROS产生和细胞凋亡；我们证明了布比卡因和罗哌卡因可通过激活AMPK致SH-SY5Y细胞ROS爆发性增多，从而引起细胞凋亡。我们进一步研究布比卡因和罗哌卡因致SH-SY5Y细胞ROS增多，对细胞线粒体Cl-通道和p38 MAPK的影响，以揭示线粒体Cl-通道和p38 MAPK信号传导通路在局麻药致SH-SY5Y细胞凋亡中的作用，结果发现布比卡因可能通过引起细胞ROS增多后，使线粒体的VDAC通道开放，Cl-进入线粒体内，导致线粒体膜电位降低、通透性增大和p38 MAPK激活导致SH-SY5Y 细胞凋亡。 罗哌卡因引发SH-SY5Y细胞ROS增多后，使线粒体的通透性转移孔开放，导致线粒体膜电位降低、通透性增大和p38MAPK激活， SH-SY5Y 细胞凋亡；而线粒体Cl-通道可能与罗哌卡因诱导的线粒体膜电位下降和细胞凋亡无关。本研究提示局麻药可能通过干扰氧化磷酸化和抑制线粒体呼吸链复合物I，使ATP生成减少，导致AMPK持续激活，并造成细胞内ROS爆发，局麻药导致细胞内ROS增多，可使线粒体的VDAC通道开放，Cl-流入线粒体，导致渗透压增高，线粒体基质肿胀和膜电位下降，线粒体的通透性进一步增高，释放出细胞色素C、AIF等促凋亡因子和更多的ROS，并激活p38MAPK蛋白，最终导致细胞凋亡。本课题研究结果已在国内外发表论文十余篇。其中SCI收录4篇，课题组多位成员多次参加了国内重要麻醉学年会进行了论文比赛和学术交流，论文获“2011年及2012年中华医学会全国麻醉学术年会中青年优秀论文竞赛”优秀奖和“贝朗杯”第四届及第五届全国青年麻醉学科医师学术论坛优秀论文优秀奖。本课题已培养多名博士研究生和硕士研究生。