自噬及其调控在急性脑梗死发病机制中的作用

Neuron survival is closely related to ischemic time in ischemic injury. To observe the dynamic level of autophagy after ischemic, oxygen and glucose deprivation (OGD) treatment in hippocampal neuron and mice model with permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO) were respectively used.The level of autophyage following tissue injury and repair process was studied at different time points after acute cerebral infarction. In this study, the ultrastructure morphological changes of autophagosomes (APs), autolysosome (ALs), Golgi apparatus, endoplasimic reticulum, mitochondrion were observed by transmission electron microscopy (TEM). The expression level of LC3, TOR, beclin-1, Caspase-3, ATG5, and ATG8 were detected with Western blotting in the different stages of acute cerebral infarction. The subject aim to verify the following hypothesizes: first, we identify the relationship between autophyage and activities and morphological changes of neuron in the different stages of acute cerebral infarction. Then we knockdown the expression of beclin-1 pathway using RNA inference technique to observe the effect of expression of autophagy-related proteins on ischemic injury. To further explore the mechanism of autophagic regulation, we also introduce the patch clamp and mitotrack technique to detect cell membrane permeability, mitochondrial membrane potential and the current of Ca2+ etc after acute cerebral infarction at different time points. This study provides the theoretical basis of potential drug targets for the treatment of cerebral infarction.

缺血性损伤过程中，神经细胞的存活与缺血时间密切相关。神经细胞对缺血损害非常敏感，缺血性损伤后，神经细胞自噬水平随着缺血时间的不同而发生变化。我们利用氧糖剥夺海马神经元细胞模型和大鼠永久性大脑中动脉梗塞模型，观察急性脑梗死后的组织损伤和修复过程中不同时间点神经细胞的自噬水平，主要包括透射电镜观察自噬小体、自噬溶酶体、线粒体、内织网结构等细胞超微结构的变化, 采用免疫印迹法检测LC3、TOR、beclin-1、Caspase-3、ATG5、ATG8等蛋白的表达水平，首先明确在急性脑梗死的不同阶段，神经细胞活性、形态的变化与自噬的关系; 其次利用小RNA沉默技术干扰beclin-1途径，观察自噬相关蛋白的表达与缺血损伤的关系；为进一步揭示自噬调控的机制，还利用膜片钳等技术检测技术检测急性脑梗死后不同时间点细胞膜的通透性、线粒体膜电位以及Ca2+等，为脑梗塞的治疗提供新的理论依据和可能思路。

背景：自噬通过回收再利用蛋白质和受损细胞器来维持细胞内环境稳定，在大多数情况下自噬被认为是促进细胞存活的。至今，越来越多的证据表明自噬参与脑缺血损伤的病理过程。然而，在脑缺血损伤中自噬究竟是起一种内源性保护机制，还是恰恰相反导致细胞死亡，目前尚有争论。最近，有研究认为缺血损伤时自噬过程的受损而不是过度自噬致使细胞死亡。缺血后处理(ischemic postconditioning，IpostC)是指在脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion ，I/R)时予以短暂的缺血干预，已被证实能产生多种内源性保护作用，减轻脑缺血再灌注损伤。而自噬在脑缺血后处理的病理过程中起什么作用，是否不同于脑缺血再灌注？目前少有研究，我们预测自噬在两者中可能起不同作用。.目的：本研究通过大鼠局部脑缺血再灌注及缺血后处理模型来证实缺血后处理的神经保护作用，同时探索自噬在这过程中的作用及其机制。.方法：使用线栓方法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型（I/R），在大脑中动脉闭塞100分钟后移去线栓恢复动脉血流；缺血后处理（IpostC）则是在血流恢复10分钟后再次插入线栓闭塞大脑中动脉，再次阻断血流10分钟后移去线栓恢复动脉血流。为评估自噬在缺血后处理中的作用，自噬抑制剂3MA在再灌注前30分钟经颅注射入大鼠局部脑缺血侧侧脑室（IpostC+3MA）。实验中成年SD大鼠分为5组：对照组（sham），脑缺血再灌注组（I/R），脑缺血后处理组(IpostC)，脑缺血后处理+3MA(IpostC+3MA)组及脑缺血后处理+Veh组（IpostC+3MA的对照组）。缺血24小时后采用mNSS评分评估大鼠神经损伤程度，取脑做焦油紫染色评估梗死面积。进一步通过Western blot 和免疫组化检测自噬相关蛋白；透射电子显微镜检测自噬体、自噬溶酶体和线粒体的数目、形态变化；TUNEL分析皮层神经元凋亡。.结果：与I/R组相比，IpostC组减少脑梗死面积将近40%，神经功能评分改善（p<0.05），而3MA干预后脑梗死面积和神经功能评分没改善。Western blot 、免疫组化和透射电子显微镜检测显示在I/R和IpostC+veh组均有自噬体形成增多(P<0.05 vs sham)，而IpostC+3MA抑制了自噬体的形成。在I/R组，LC3-II/LC3-I、beclin-1、p62表达增高，