水稻内生细菌Pantoea sp Sd-1高效降解秸秆木质素机理研究

The degradation difficulty of lignin component seriously affects the effective utilization of crop straw. Although common ligninolytic strains have been isolated outside the plant body, no breakthrough results in lignin-biodegradation research was obtained. Some endophytes with promising ability to degrade lignin barrier have been discovered recently. But endophytic bacteria with such capability were seldom found, and the mechanism behind this is still unclear. In our preliminary we successfully isolated a rice endophytic bacterial strain Pantoea sp Sd-1. This strain can degrade rice straw and lignin with a remarkable efficiency. In the meantime, we have started to build a study system for exploring the lignin-biodegradation mechanism of plants. In this project, we plan to carry out the following researches with Sd-1:1)Construct a database for lignin-degradation genes using sequencing and analysis of Sd-1 genome; 2)Construct protein profiles of Sd-1 lignin-degradation enzyme and confirm the corresponding enzyme system; 3) Clone the genes of key enzyme within the lignin-degradation pathway in Sd-1 and purify the proteins; 4)Explore the action model of lignin-degradation enzyme system in Sd-1.This project aims to combine the related biological technologies and new microorganism resource to establish a possible mechanism of endophytic lignin degradation. The results of this research will provide valuable information for further understanding of lignin-degradation mechanism in bacteria and can also lay a foundation for the viable utilization of crop straw through entophytic treatments.

木质素难降解是影响水稻秸秆有效利用的最重要因素之一，其生物降解菌研究主要集中于来自植物外部环境的微生物，但尚未有突破性进展。近年来发现某些内生菌更能有效破除植物内木质素屏障，但此类内生细菌较稀少，其高效降解机理更不清楚。申请者前期已成功筛选出1株高效降解水稻秸秆木质素的水稻内生细菌Pantoea sp Sd-1，并初步建立了木质素降解机理研究的试验系统。本课题拟以Sd-1为材料，开展以下研究：1）测定Sd-1全基因组序列，构建其木质素降解功能基因数据库；2）构建Sd-1木质素降解功能酶蛋白谱，分析确定其酶系；3）克隆Sd-1木质素降解关键酶基因，获取其酶蛋白；4）揭示Sd-1木质素降解酶系作用模式。本研究结合新的菌种资源与生命组学等相关技术，研究阐明植物内生菌独特的木质素降解机制。成果将为完善细菌木质素降解机理提供有价值的科学信息，为植物内生菌用于秸秆废弃物资源化利用奠定理论基础。

木质素的高效降解是秸秆等木质纤维素材料开发和综合利用中亟待解决的难题。近年来发现某些内生菌更能有效破除植物内木质素屏障，但此类内生细菌较稀少，其高效降解机理更不清楚。本课题以前期已成功筛选出的1株高效降解水稻秸秆木质素的水稻内生细菌Pantoea sp Sd-1（后经系统分析，鉴定为Pantoea ananatis）为研究对象，进一步深入开展其作用机制的研究。.1．系统研究了Sd-1降解水稻秸秆的特性和并探索了其最佳降解条件。6天内可以使水稻秸秆的总重量及其纤维素、半纤维素和木质素组分的含量分别减少62.7%、75.2%、78.8%和35.6%。.2. 测定和分析了Sd-1的全基因组序列，并建立其木质纤维素降解相关基因数据库。生物信息学分析鉴定出大量与木质素降解相关基因，高于大部分细菌水平。.3. 从转录水平、酶活性和蛋白质组学层次对Sd-1的木质纤维素降解酶系进行了解析，证明Sd-1木质纤维素降解相关酶活性是受底物所诱导调控。.4. 鉴定和纯化了Sd-1木质素降解途径中一些新型的关键酶基因和酶蛋白。鉴定出Lac4为新的细菌漆酶，PaP2Ox为迄今发现的第二例细菌吡喃糖氧化酶，CarE7为新的细菌羧酸酯酶。通过克隆、原核表达及纯化，获得了相关酶蛋白并验证了其在木质纤维素降解中所起的作用。.5. 首次在细菌中分析并验证了其在降解木质纤维素过程中存在依赖芬顿反应的非酶氧化体系。生物信息学研究预测及实验数据显示 Sd-1降解秸秆途径是羟基自由基依赖型，且发现Sd-1与芬顿试剂处理后的水稻秸秆成分化学结构变化类似。进一步从代谢产物、基因转录水平和酶活检测多方面确证Sd-1降解反应中存在芬顿反应的两大要素，即Fe3+还原活性和过氧化氢的产生。.本研究探明了P. ananatis Sd-1木质素降解途径及参与的木质素降解酶系，对其关键酶基因和酶蛋白进行鉴定，揭示其木质素降解作用模式。研究结果为目前尚未明确的细菌木质纤维素降解机制的阐明提供了更充分的科学依据，具有重要的科学价值。同时，为植物内生菌这一丰富的生物资源应用于秸秆废弃物资源化利用奠定基础。