碳酸酐酶III与重症肌无力发病的相关性及机制的研究

Myasthenia gravis(MG) is an antibodies-mediated, heterogeneous autoimmune disease. Anti-AChR and Anti-MuSK antobodies present in 90%-95% patients. 5-10% patients are still in obscure. And the antibody mechanism still can not explain the fatigue we see in MG patients. Our previous study found that P25 protein is dramaticly reduced in muscles of MG patients. MALDI-TOF suggested P25 is carbonic anhydrase III(CAIII). We subsequently proved that CAIII is reduced in protein and mRNA levels in MG patients, but the mechanism is still unknown. Here we first observe the CA III protein and mRNA levels in AChR and MuSK antibodies treated C2C12 cells. Second, using CAIII over expression or blocked cell models, observe the effect of CAIII over expression and blockage on the AChR quantity and Agrin induced AChR assembly. Finnally using RNA interferrin, observe the AChR and ColQ levels in CAIII silenced models, and the CAIII level in MuSK silenced models in vivo. This study will elucidate the correlation and the possible roles that CAIII plays in the pathogenesis of MG.

重症肌无力（MG）是一种由抗体介导的、多因素参与的自身免疫性疾病，这可能与乙酰胆碱受体（AChR）抗体和MuSK抗体的产生有关，但还有5－10%的病人病因未明。且目前的抗体机制仍不能解释MG病态的易疲劳等现象。我们前期发现P25蛋白在MG患者骨骼肌中表达降低，并确认P25蛋白是碳酸酐酶III(CAIII)，进一步检测发现CAIII的蛋白和mRNA在MG患者中均有降低，但其与MG发病的相关性及机制尚不清楚。在此基础上，我们拟首先在AChR损伤和MuSK通路损伤的MG细胞模型中观察CAIII的表达变化；然后进一步观察CAIII高表达或功能阻断对AChR数量及聚集功能的影响；最后利用RNA干扰技术抑制在体组织中CAIII或MuSK的表达，探讨CAIII与AChR及MuSK抗体机制间的相互影响。本项目的完成有助于了解CAIII与MG的相关性及作用机制，为MG发病机制的研究提供新的理论依据。

我们前期的研究发现碳酸酐酶III（carbonic anhydrase, CA III）在MG患者骨骼肌中特异性减少，本课题原设计拟应用细胞模型和在体模型研究CA III的高表达和功能抑制对突触后膜AChR的数量影响，及CA III对Agrin诱导的AChR聚集功能的影响。鉴于近年国际上对MuSK抗体相关的MG取得了较多的进展，阐明了Agrin、脂蛋白相关蛋白4（LRP4）、MuSK与 AChR聚集的关系，并对MuSK通路相关的MG亚型做了较深入的阐述。本研究暂缓了“CA III对Agrin诱导的AChR聚集功能的影响”的研究内容。且近年国外学者发现内质网应激（ER stress）在自身免疫病的发病机制中起到重要作用，并且在MG患者中有内质网应激的分子伴侣葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的高表达现象，提示内质网应激也有可能参与MG的发病机制。因此我们认为应用细胞模型和EAMG动物模型共同阐述CA III在MG发病机制的作用、并加做内质网应激的内容更加有利于揭示MG新的发病机制。.本研究的主要研究结果如下：.1、.（1）成功制备了EAMG动物模型，MG模型小鼠活动度降低，前爪抓力能力减弱，肌肉重复电刺激衰减>10%，血清AChR抗体升高。（2）CA III的抑制剂（TFMS）能够明显加重小鼠的肌无力症状以致于数天内因呼吸衰竭而死亡；而CA III的激动剂(Piperazine)可以明显改善小鼠的肌无力症状和前爪抓力，改善肌肉重复电刺激的衰减现象；降低血清中的AChR抗体滴度。（3）在EAMG小鼠肌肉中检测到内质网应激相关蛋白GRP78的高表达，提示内质网应激可能参与MG的发病机制。.2、.（1）用含有CAIII的shRNA抑制C2C12细胞中CAIII的表达，AChR的内化增加；提示CA III参与MG的发病机制有可能与对AChR的内化保护作用有关。（2）应用衣霉素（TM）和毒胡萝卜素（TG）诱导C2C12细胞的内质网应激，细胞中AChR的内吞作用增加；（3）应用siRNA抑制C2C12细胞中内质网应激蛋白XBP- 1的表达，AChR的内吞减少；提示内质网应激可能通过加速C2C12细胞中AChR的内化而加速AChR的降解过程。