少量造血干细胞中高通量蛋白质翻译后修饰组学研究

Due to the requirement of a large amount of samples and the difficulty in enriching modified peptides, the traditional proteomic technique for post-translational modifications is unable to be used for detecting modifications in a limited number of cells in a high-throughput manner. In order to overcome this issue, the applicant has developed novel technique named ISEQ-PTM for acetylomic analysis by using a chemical reagent named Map-Kac to boost the detection of acetylation by mass spectrometry. This new technique allows to detect acetylation with microscale sample input. Based on these results, in this project, we will further develop a reagent Map-Kub for ubiquitinomic studies and also optimize Map-Kac. In addition, we will apply ISEQ-PTM to profile the age-associated acetylome and ubiquitinome in rare cell populations including HSC and MPP2. Finally, we will find some critical modification sites related to HSC aging by performing integrative analysis of the acetylome and ubiquitinome data of HSC, and elucidate the functions of histone acetylation during HSC aging using ChIP-seq. In summary, this art-of-state technique, significantly reducing the sample input by nearly 1000 fold, will fascinate the high-throughput proteomic analysis of post-translational modifications in rare population of cells and promote the development of biomedical research.

传统蛋白修饰组学技术因样品使用量大，富集困难，不能满足在少量细胞中高通量检测翻译后修饰的要求。为了解决这一难题，申请人前期发展了一种可以增强蛋白乙酰化检测的化学添加剂Map-Kac，并利用该化学添加剂开发了检测蛋白修饰的新技术ISEQ-PTM，实现了可以在微克级提取蛋白中检测翻译后修饰。在此基础上，本项目将（1）开发增强蛋白泛素化检测的化学添加剂Map-Kub，并优化Map-Kac；（2）利用新技术ISEQ-PTM，系统研究分离得到的稀少细胞包括造血干细胞HSC和造血干祖细胞MPP2衰老过程中的乙酰化和泛素化动态变化；（3）整合分析并发现与HSC衰老密切相关的乙酰化和泛素化位点，并利用ChIP-seq技术研究关键组蛋白乙酰化位点在调控HSC衰老过程中的功能。这项蛋白修饰组学新技术将样品使用量降低了近1000倍，彻底解决在少量细胞中高通量检测蛋白修饰这一难题，必将极大推动生物医药领域的发展。

传统蛋白修饰组学技术因样本使用量大，富集困难，不能满足在少量细胞中高通量检测翻译后修饰的要求。本课题以少量细胞的高通量翻译后修饰检测为切入点，优化前期开发的基于化学添加剂Map-Kac的蛋白修饰检测新技术Iseq-PTM，借助该技术Iseq-PTM开展造血干细胞（HSC）及其祖细胞（MPP1、MPP2和MPP3）这四种稀有细胞衰老相关的乙酰化组学研究，并阐明关键乙酰化位点H4K77ac调控造血干细胞衰老过程中的功能。此外，本课题还开发了增强蛋白泛素化检测的化学添加剂Map-Kub，并借助化学添加剂Map-Kub，描绘Thy1a、Thy2a、Thy2b、Thy2c、Thy3和CD123六种胸腺发育相关T细胞的泛素化图谱。本课题获得以下4个重要进展。1）通过优化化学添加剂的合成步骤、化学添加剂与蛋白样本的反应比例开发了可用于高通量检测样本乙酰化和泛素化的化学添加剂Map-Kac和Map-Kub；2）参考文献报道的少量细胞的前处理过程，结合化学添加剂Map-Kac和Map-Kub的前处理性质，实现了在103个细胞水平高通量定性定量分析蛋白质乙酰化和泛素化；3）分别在造血干细胞（HSC）及其祖细胞（MPP1、MPP2和MPP3）这四种稀有细胞中，与Thy1a、Thy2a、Thy2b、Thy2c、Thy3和CD123六种胸腺发育相关T细胞中验证了该技术的普适性；4）发现多个与造血干细胞及其祖细胞（HSPCs）衰老相关的乙酰化位点，并挑选了在HSC中显著下调的关键组蛋白乙酰化位点H4K77（H4K77ac）进行体内体外的功能验证。功能验证中找到了H4K77ac的去乙酰化修饰酶HDAC3，并初步证明了H4K77ac促进淋系的分化并抑制髓系的作用。我们的研究结果为深入理解老年造血干细胞谱系倾斜的表观遗传调控铺了新的道路，可能有助于平衡谱系输出和拯救老年人的骨髓倾斜。该研究开发的蛋白修饰组学新技术将样品使用量降低了近1000倍，彻底解决在少量细胞中高通量检测蛋白修饰这一难题，必将极大推动生物医药领域的发展。