疟原虫从按蚊宿主获取叶酸营养的适应性机制研究

Malaria parasite Plasmodium is transmitted by Anopheles mosquitos. Inside the mosquito, the oocysts develop and form thousands of sporozoites, which is capable of infect mammal host. In this process of maturation, oocyst extends the cell size up to 10 fold, accompanying the demand of folate for nucleotide and amino acid synthesis catabolism. Except de novo folate synthesis pathway, the Plasmodium possesses two folate transporter encoding genes (ft1 and ft2) in the genome. These proteins are supposed to provide the folate from extracellular via folate salvage pathway in the situation when the extra folate is demanded for cell proliferation. However, whether FT1 and FT2 play a critical for in the oocyst maturation and sporozoite forming is still unknown. Using CRISPR/Cas9 method, we generated the knockin modified parasites with individual ft1 and ft2 gene tagged in the rodent malaria parasite Plasmodium yoelii. Protein expression analysis indicates that only FT2 protein is expressed at the oocyst and sporozoite stages in mosquito during the life cycle. Next, we obtained the parasite clones with deletion for each ft1 and ft2 gene. The phenotyping screen indicated that gene deletion of ft2 caused deficiency in oocyst maturation, sporozoite formation and mouse infection. Through complementation with ft2 expression in ft2 gene deletion strain, the deficiency phenotype was rescued to the level of wildtype. Together, we speculated that FT2 as a folate transporter play a critical role for folate salvage in oocyst development and sporozoite formation in the mosquito. More experiments are being planned to elucidate the cell and molecular mechanisms.

疟原虫依赖按蚊传播。在按蚊宿主中，卵囊发育形成子孢子，感染哺乳动物宿主。卵囊成熟过程中细胞直径增加10倍，伴随叶酸营养的大量需求，用于核酸和氨基酸合成代谢。除自身合成，疟原虫还编码了叶酸跨膜转运蛋白FT1和FT2，通过外源攫取来满足细胞快速增殖中叶酸供应。然而，FT1和FT2蛋白是否在卵囊增殖中发挥作用，一直没有答案。前期工作中我们构建了约氏疟原虫ft1和ft2基因标签插入虫株，蛋白表达分析发现只有FT2蛋白在卵囊阶段表达；通过构建ft1和ft2基因敲除虫株，表型筛选发现ft2敲除导致卵囊成熟异常，疟原虫感染小鼠阻断；进一步分析发现，ft2敲除后卵囊子孢子增殖受到影响，子孢子产量显著下降。本课题将进一步分析自身合成途径和外源攫取途径在卵囊发育中叶酸营养供给的相互作用和代偿。通过对疟原虫叶酸跨膜转运蛋白的生理功能研究，揭示疟原虫从按蚊宿主获取叶酸营养的适应性机制；为阻断疟疾传播提供新的靶标。

疟原虫基因组编码了约100多个MTP，疟原虫营养相关的MTP来研究为开发疟疾的预防、治疗药物及疟疾传播阻断策略寻找新靶标。本项目运用遗传学方法对约氏疟原虫叶酸转运蛋白家族（Folate transporter, FT）和氨基酸转运蛋白家族（Amino acid transporter, AAT）进行机制研究。疟原虫基因组中编码叶酸转运蛋白的基因共两个ft1和ft2。我们将叶酸转运蛋白基因ft1敲除后，疟原虫生活周期生长发育正常，显示ft1基因敲除不影响疟原虫生长发育，或者FT1的功能能够被其他蛋白替代。叶酸转运蛋白FT2则是一个母系遗传的蛋白，它定位于疟原虫动合子特有的细胞器——类晶体上。FT2对于疟原虫卵囊的成熟及子孢子的形成至关重要，敲除ft2导致疟原虫只能产生极少量的唾液腺子孢子，而且唾液腺子孢子运动能力显著下降，不能通过按蚊叮咬的方式传播到小鼠。将约氏疟原虫和恶性疟原虫的ft2基因分别导入到约氏疟原虫ft2敲除虫株中，发现回补虫株都能恢复正常的唾液腺子孢子产量。这证明FT2就是调控卵囊后期孢子生殖的基因，并且它的功能在约氏疟原虫和恶性疟原虫中是保守的。. 疟原虫基因组中编码氨基酸转运蛋白的基因共有6个，氨基酸转运蛋白家族中aat3经过多次尝试仍无法成功敲除，暗示着它很可能是疟原虫红期生长发育必须的蛋白。AAT6同样在红期发挥功能，敲除aat6后的疟原虫红期生长速度显著减慢。aat1和aat5分别敲除后对于疟原虫生活周期各阶段的发育都没有显著影响，它们对于疟原虫的增殖及宿主转换可能是冗余的或者它们的功能可以被其他的AAT成员替代。AAT2和AAT4都在蚊期发挥作用，前者敲除后直接阻断了卵囊的形成，后者敲除后卵囊发育不受影响，但是产生的卵囊子孢子无法从卵囊释放出去，并且卵囊子孢子和血腔子孢子都有功能缺陷——不能感染小鼠。AAT4在卵囊早期的定位是卵囊囊膜上，到了卵囊子孢子成熟以后其定位则从囊膜转移到胞质表达，这种定位的变化体现了其功能变化：卵囊早期定位在囊膜上转运氨基酸到内部供卵囊发育，卵囊成熟后定位在卵囊子孢子，促进卵囊子孢子的释放。卵囊阶段是疟原虫生活史中虫荷最少的，即疟原虫最大的瓶颈期，是阻断疟疾传播最合适的节点。本项目对约氏疟原虫MTP进行遗传筛选，发现与营养相关的MTP主要在疟原虫蚊期发挥重要作用，为开发抗疟药提供了新的靶标。