棉花李氏突变体Li1基因的精细定位及其候选基因鉴定

It is important to fine mapping fiber developmental major genes and study of the mechanism of fiber development, for improving cotton fiber quality. In this study, the Li1 gene will be finely mapped using the F2 mapping populations from G.hirsutum L.cv. Ligon-lintless mutant ×G.barbadense L.cv. Pima S6, and fine physical map of Li1 will be constructed. Specific primers will be designed according the high homology segments from the alignment of physical map construction of Li1 and genome sequence of Raimondii for screening the BAC clones in the physical map of the Li1. The BAC clone containing Li1 gene will be identified and then sequenced, and finally candidate ORFs of Li1 will be obtained through bioinformatics analysis and sequence alignment between mutant (Li1) and wide type (TM-1). The Li1 candidate gene will be confirmed according the different expression in temporal and spatial between mutant Li1Li1 and wide type TM-1 detected by real-time quantitative RT-PCR; the molecular mechanism of Li1 mutant phenotype of no long fiber will be found according the expression site of Li1 gene during cotton fiber development by In Situ hybridization. Simultaneously, the correlation of Li1 gene expression in different fiber developmental stages and the data of fiber qualities will be analyzed to demonstrate the relationship between them. This result will provide theoretical foundation of the study Li1 gene for regulation mechanism of fiber development.

精细定位棉纤维发育主效基因和阐明纤维发育的机理对改良棉花纤维品质具有重要意义。本研究利用只有超短绒的陆地棉李氏突变体（Li1Li1）和Pima S6（海岛棉）杂交的F2群体，精细定位突变体Li1基因，并构建Li1基因精细物理图谱。根据Li1物理图谱和雷蒙德氏棉基因组序列比对的高度同源区段设计引物，对物理图谱上的BAC克隆进行扫描，鉴定出包含Li1基因的BAC克隆并进行全长测序。通过基因预测和序列差异分析获得Li1基因的候选ORF。利用实时荧光定量PCR分析Li1基因在突变体Li1Li1和野生型TM-1的时空表达差异以及在突变体的表达特征；利用原位杂交检测Li1基因在棉纤维发育的表达部位，推测出突变体无长纤维表型的分子机理；将Li1基因在纤维不同发育时期的表达量和纤维品质指标进行关联分析，明确Li1基因时空表达特征与纤维品质的关系，为阐明Li1基因对纤维发育的调控机制提供理论基础。

肌动蛋白的微丝对动植物的细胞形态建成和伸长是至关重要的。棉花纤维是高度特化的单细胞，其长度的增加量能到到直径的1000-3000倍。研究发现微丝骨架的成束与棉花纤维细胞的伸长生长密切相关。利用高密度物理图谱结合TM1基因组数据，本研究分离到了Li1突变体的候选基因是一个微丝蛋白相关基因，命名为GhACT17。GhACT17基因序列分析发现， D染色体组的野生型和突变型只有一个碱基的差异，即 GhACT17蛋白的第65个氨基酸由一个亲水甘氨酸（Gly）变为一个疏水缬氨酸（Val）。在拟南芥和陆地棉中过表达GhACT17-DM基因都会出现类似Li1突变体的表型，植株扭曲，弱小或无长纤维等突变的表型。分离了GhACT17-A和GhACT17-D的启动子，在拟南芥叶片中，GhACT17-D的启动子下GUS活性显著高于GhACT17-A的启动子活性。定量 PCR分析，GhACT17-DM基因在棉花的叶片和开花后10d的纤维优势表达。这些结果表明，极有可能是由GhACT17-D基因的一个单碱基发生改变，影响纤维细胞的伸长，导致Li1突变体的成熟纤维仅有5-6 mm，没有长绒纤维以及叶片卷曲突变的表型。为了进一步阐明Li1突变体纤维发育的机理，本研究试图分析Li1突变体和野生型的胚珠和纤维的微丝动态变化规律，明确纤维细胞的微丝骨架变化动态对Li1突变体的纤维发育的影响作用。从细胞生物学角度，揭示棉花李氏突变体只有短纤维而没有长绒的纤维发育机制。