锌对胰岛素抵抗状态下PI3K-Akt/mTOR-S6K1信号传导网络调控机制的研究

为进一步研究锌改善糖尿病糖代谢紊乱的分子机制，本课题在前期研究的基础上，采用体外培养与动物实验相结合的方法，以胰岛素抵抗肝细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞模型及2型糖尿病大鼠动物模型为研究对象，运用RNA干扰、实时定量PCR、分子杂交、免疫荧光、激光共聚焦显微镜等技术，观察锌对2型糖尿病胰岛素信号传导体系中生物学靶点的影响，筛选出锌作用于胰岛素抵抗状态下的PI3K-Akt/mTOR-S6K1信号传导体系的生物学靶点并确定其最终调节效应；明确锌对筛选出的生物学靶点调节作用的方式（基因转录、蛋白表达、活化水平、分子移位能力等），并初步确定动物实验中锌改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗状态的安全有效作用剂量。研究结果将为阐明锌对胰岛素抵抗状态下PI3K-Akt/ mTOR-S6K1信号传导网络的调节机制提供实验基础与理论依据。为以营养素预防和控制胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生与发展提供有益的线索和新的研究思路。

体外实验：探讨了锌对HepG2、3T3-L1、L6正常细胞和胰岛素抵抗细胞糖代谢的影响。采用免疫沉淀、Western Blot、实时定量PCR、间接免疫荧光及激光共聚焦显微镜等技术，观察了锌对胰岛素抵抗状态下HepG2、3T3-L1、L6细胞胰岛素信号传导通路中关键靶点的蛋白质表达及其磷酸化状态、转录水平及分子易位的影响。结果显示，锌具有一定的胰岛素样作用，可提高HepG2、3T3-L1、L6细胞对葡萄糖摄取，促进HepG2细胞糖原合成，抑制HepG2糖异生。其可能机制①上调HepG2细胞中pY-IRβ、IRS1-P85α、AKT Ser473、GSK3β Ser9、FoxO1 Ser256的磷酸化水平，增强糖原合成、抑制糖异生；②上调3T3-L1细胞中pY-IRβ、AKT Ser473的磷酸化水平；促进GLUT4分子易位；③上调L6细胞中AKT Ser473、GSK3β Ser9的磷酸化水平、促进GLUT4分子易位、抑制胰岛素抵抗细胞mTOR、S6K1及其磷酸化的过表达等。体内实验：观察了锌对胰岛素抵抗大鼠及2型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性及糖代谢的调节作用。结果显示，锌可以提高胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性，降低LDL-C的浓度；可上调胰岛素抵抗大鼠肝脏pY-IRβ、IRS1-P85a、AKT Ser473、GSK3β Ser9、FoxO1 Ser256的磷酸化水平。研究结果还显示，锌对于胰岛素抵抗大鼠肝脏的GCK、PEPCK、G-6-Pase的mRNA表达未见调节作用；对于胰岛素抵抗大鼠脂肪组织、骨骼肌组织中胰岛素信号通路的关键靶点的蛋白表达及磷酸化水平未见明显的调节作用；对于血糖水平较高的2型糖尿病大鼠模型的糖脂代谢也未显示出明显的改善作用。结论：锌对胰岛素抵抗的HepG2、3T3-L1、L6细胞模型及胰岛素抵抗大鼠具有一定的胰岛素样作用；锌对胰岛素抵抗细胞模型的有效作用剂量已超过健康成人血浆锌生理浓度范围；对胰岛素抵抗大鼠模型的有效作用剂量也已超过健康成人锌可耐受最高摄入量（UL），但此剂量下大鼠肝肾功能及组织病理学检测未见异常。上述研究结果为临床上安全合理地应用锌防治胰岛素抵抗相关疾病提供了实验依据。也提示出今后的研究方向------对胰岛素抵抗及糖尿病等病理状态下机体对锌的代谢、需要量等方面需要做进一步探讨；对胰岛素抵抗状态时锌干预的安全性需要进一步评估。