草鱼IL-4异构体的分子鉴定及其参与巨噬细胞极化的功能探究

Interleukin (IL) -4 is the key regulatory cytokine in the cellular immunity, and its classical functions are to induce macrophage polarization and participate in the differentiation of T helper cells, which naturally integrates the innate immunity and the adaptive immunity. In consideration of the low conservative properties of IL-4 amino acid sequences from different species and unclear functional role of fish IL-4, the function and mechanism of fish IL-4-mediated cellular immunity remain to be determined. In this project, two IL-4 isoform genes from grass carp are isolated and cloned, and their recombinant proteins will be obtained and used to analyze and compare their functional discrepancy in the regulation of marker molecule expression in grass carp lymphocytes, thereby learning their functional redundancy or complementarity, and functional conservation during evolution. Furthermore, much emphasis will place on IL-4-induced macrophage polarization, especially the role and regulatory mechanism of IL-4 in the differentiation of M2-type macrophages, uncovering the immune function of IL-4-drived M2 macrophages. These results not only identify the immunoregulatory function of fish IL-4, but also reveal the role, related mechanism and physiological significance of fish IL-4 in macrophage polarization, thereby adding new contents of fish cellular immunity based on the involvement of both the innate immunity and the adaptive immunity.

白细胞介素4（IL-4）是细胞免疫的关键调节因子，其经典功能是诱导巨噬细胞极化和参与辅助性T细胞的分化，从而有机整合了固有免疫和获得性免疫。 IL-4的氨基酸序列保守性低，鱼类IL-4的功能不明，以至于IL-4介导的鱼类细胞免疫调节及其机制还有待阐明。本课题从草鱼中分离克隆到两个IL-4的异构体基因，拟分别获得它们的重组蛋白，分析和比较它们诱导草鱼淋巴细胞标志分子表达的功能差异，鉴别它们生物学功能的冗余性或互补性，以及进化过程中的功能保守性。在此基础上，本项目重点关注草鱼IL-4在诱导巨噬细胞极化，尤其是M2 型巨噬细胞产生过程中的功能地位和相关机制，并进一步揭示草鱼IL-4诱导的M2型巨噬细胞的免疫学功能。这些结果不仅明确鱼类IL-4异构体的免疫调节功能，而且获悉基于IL-4作用的鱼类巨噬细胞的极化过程、机制和生理意义，进而增加固有免疫与获得性免疫共同参与的鱼类细胞免疫新内容。

哺乳动物巨噬细胞的激活状态大致可分为两种，一种是由Th1型细胞因子IFN-驱动的M1型巨噬细胞的极化，另一种是由Th2型细胞因子IL-4驱动的M2型巨噬细胞的极化。此外，在鱼类的基因组中发现了与哺乳动物IL-4和IL-13两种Th2型细胞因子对应的分子，分别被命名为il-4/13a和il-4/13b。本项目使用同源克隆的方法，分离出一个新的草鱼il-4/13 cDNA。推导的氨基酸（aa）序列的系统发育树和序列比对结果显示它更接近gcIl-4 / 13b，因此被命名为gcil-4/13b-like（gcil-4/13bl）。其编码序列（CDS）长度为399 nt，小于gcil-4 / 13b（408nt）。我们还克隆得到了gcil-4/13bl基因，其长度约为1600 bp，具有4个外显子和3个内含子的保守性的基因结构。然而，除了CDS序列上的多处不同之外，gcil-4/13bl基因具有比gcil-4 / 13b更长的内含子3，表明gcil-4/13bl是由一个新基因编码的。组织分布实验表明gcil-4/13bl转录物具有普遍分布的特点，并且在脑和头肾这两个组织中几乎只检测到gcil-4/13bl。使用大肠杆菌（E.coli）Rosetta-gami2（DE3）制备重组草鱼gcil-4/13bl（rgcIl-4 / 13bl）。功能研究表明，rgcIl-4 / 13bl上调精氨酸酶-2 mRNA表达和精氨酸酶活性，同时下调一氧化氮（NO）产生以及新鲜分离的草鱼头肾单核细胞/巨噬细胞（M0 /M）中的诱导型一氧化氮合酶（inos）和ifn-转录物，表现出激活M2型而拮抗M1型巨噬细胞的保守功能。这些功能性研究结果证明il-4 / 13bl可编码功能性基因。此外，rgcIl-4 / 13bl能够驱动由重组草鱼巨噬细胞集落因子（rgcM-csf）预处理的M0 /M的增殖，推测rgcIl-4 / 13bl具有诱导分化的巨噬细胞增殖的能力。我们的研究结果不仅在草鱼基因组中发现了一个新的il-4/13编码基因，而且还首次揭示了鱼类Il-4/13与M-csf协同作用以促进M0 /M增殖的新功能。