猪β防御素2体外抗菌的作用机理研究

由于抗生素的长期使用和滥用，不仅造成抗生素残留，而且使许多致病菌对抗生素产生了耐药性，使得猪的发病率和死亡率居高不下，制约了养猪业的发展，也严重威胁着人类健康。防御肽对耐药菌株有杀灭作用，并具有抗菌谱广、无免疫原性、无药物残留等优点，使其有望成为新型的抗菌制剂。猪β防御素2（pBD2）是猪分泌的一种防御肽，杀菌活性强，细胞毒性小，对猪疾病的防治具有重要意义，但是其抗菌的作用机理尚不清楚，制约了其在实践中的应用。本课题组已经克隆表达了pBD2基因，证明其对致病菌有强烈的杀菌作用。为阐明pBD2的作用机理，拟先确定pBD2作用致病菌的最适浓度与时间，在此基础上，采用免疫电镜技术，确定pBD2与致病菌作用一定时间后的位置及其致病菌的变化；而后利用基因的差异表达显示技术，分析致病菌与pBD2作用前后差异表达的基因，以期阐明其抗菌作用机理，为其在实践中的应用奠定基础。

猪β防御素2（pBD2）对临床分离的猪肠道致病菌有很强的抑杀作用，对猪病防治具有重要意义。我们在前期实验基础上，通过观察与pBD2共培养前后细菌形态变化及其pBD2在细菌中的位置，并通过genefishing技术找到差异表达的基因片段，分析其功能，进一步进行荧光定量PCR验证，对其杀菌机理进行探讨。结果如下：（1）对pBD2基因进行了优化，使其表达量提高了4-6倍。纯化后的pBD2免疫兔子和小鼠，分别得到了抗体，纯化后，通过ElISA、 Western blot和免疫组化实验，证明制备的抗体具有很好的免疫原性和特异性。（2）细菌与不同浓度pBD2共培养不同时间后，扫描电镜分析可见pBD2可使大肠杆菌的细胞膜皱缩，出现孔洞，内容物外泄死亡；免疫荧光分析显示由FITC染色的绿色荧光主要集中在细菌外围，并有可能进入到细胞质中。免疫电镜显示pBD2相对集中在大肠杆菌细胞质中。金黄色葡萄球菌的扫描电镜结果显示：pBD2可使金黄色葡萄球菌的细胞膜出现凹陷，局部出现白色变化，可看到细胞死亡的碎片。免疫荧光分析可见，FITC染色的绿色荧光主要集中在细菌外围，在细菌外围形成了一个明显的环。免疫电镜显示pBD2相对集中在金黄色葡萄球菌细胞膜上。（3）通过细菌与pBD2共培养前后差异表达的基因分析，在大肠杆菌中共得到38个差异表达的片段，在已知功能的28个基因中，有6个与运输相关的蛋白，13个与DNA转录和翻译有关的基因，9个与糖代谢、氨基酸代谢等相关的基因。在金黄色葡萄球菌中，共得到29个差异片段，在已知功能的28基因中，有9个离子或者蛋白跨膜运输的蛋白，3个DNA修复蛋白，5个转录和翻译相关的基因，11个与其他代谢相关蛋白。（4）荧光定量PCR的结果基本与差异表达基因的结果一致，大肠杆菌中，离子和跨膜运输基因的表达量基本以上调为主。与DNA转录翻译相关的基因以下调为主；金黄色葡萄球菌中，离子和跨膜运输蛋白的表达量基本以下调为主，与DNA转录翻译相关的基因也是以下调为主。综合以上结果，认为pBD2杀死大肠杆菌的主要原因是细胞膜破坏后，影响了DNA的转录和翻译。杀死金黄色葡萄球菌的主要原因是细胞膜的破坏。本研究初步揭示了pBD2体外杀菌的作用机理，为pBD2替代抗生素在猪病防治中的应用奠定了良好的理论基础，对其实际的应用提供了理论依据。