DNA甲基转移酶SlCMT4调控番茄果实成熟的表观遗传机制研究

DNA methylation is involved widely in the regulation of the temporal and spatial gene expression for plants. DNA methyltransferase inhibitor 5-azacytidine induces tomato fruit premature ripening and it is demonstrated that DNA methylation contributes to the regulation of fruit ripening. During study on tomato fruit ripening, we cloned a DNA methyltransferase SlCMT4, which expresses highly in inmature green fruit and declines during fruit ripening. The expression level of SlCMT4 in the tomato ripening mutants rin and Nr is more higher compared to wild type tomato and the SlCMT4 expression is negatively regulated by ethylene signal and ripening-related transcriptional factor MADS-RIN. We speculate that the abnormal fruit ripening in mutants Nr and rin might be related to the concurrent hypermethylation of multiple ripening-related genes by DNA methyltransferase SlCMT4. In this study, we shall make a RNAi silencing vector and an over-expression vector with tomato SlCMT4 cDNA, transform wild type tomato, get transgenic plants with silenced and over-expressed SlCMT4. At the same time, we shall transform mutants rin and Nr with the SlCMT4 RNAi silencing vector and get transgenic plants with silenced SlCMT4. We shall analyse the expressions of fruit ripening-related genes and the phenotypes related to fruit ripening, quality and storability. Bisulphite sequencing will be used to determine methylation status of fruit ripening-related gene promoters. The research work will illuminate the function of SlCMT4 and shed more light on the molecular regulatory mechanism of fruit ripening and storability.

DNA甲基化广泛参与基因的时空表达调控，用甲基化抑制剂处理，可以提早番茄果实成熟，表明DNA甲基化参与到果实成熟的调控。我们克隆到在番茄青果期高量表达的DNA甲基转移酶基因SlCMT4，在成熟突变体Nr和rin果实中，该基因的表达水平显著高于野生型番茄，受乙烯信号和转录因子RIN负调控。推测Nr和rin果实不能正常成熟，可能与许多成熟相关基因启动子被SlCMT4高度甲基化有关。本研究拟构建该基因的超表达和RNAi沉默载体，转化野生型番茄AC++，筛选目标基因超表达和沉默的转基因株系；利用RNAi沉默载体，转化突变体Nr和rin，筛选目标基因沉默的转基因株系；深入研究SlCMT4对番茄果实成熟期、果实成熟特异基因的表达、风味色泽和耐贮性影响；并研究果实成熟特异基因启动子的甲基化水平。本研究对明确SlCMT4基因功能，阐明果实成熟的分子调控机理具有非常重要的科学意义。

DNA甲基化在植物生长发育、基因表达调控和基因组稳定性维持中起着重要作用。我们进行了9个番茄甲基转移酶的生物信息学分析，这些甲基转移酶被分为4个已知的亚家族。结构分析表明它们的DNA甲基化酶结构域是高度保守的，而N端是不同的。组织/器官特异性分析表明，SlCMT2、SlCMT3和SlDRM5在幼叶中的表达较高，而SlMET1、SlCMT4、SlDRM7和SlDRM8在未成熟的青果实中高表达，并随着果实的进一步发育，它们的表达量不断下降。SlMETL在成熟果实中高表达，并在果实发育过程中呈现上调趋势。此外，与野生型番茄相比，突变体rin和Nr番茄成熟中SlCMT4的表达显著提高，表明SlCMT4受到乙烯信号和成熟调节因子MADS-RIN的负调控。迄今为止，关于番茄中DNA甲基化维持的调控和功能研究仍然缺乏。在本研究中，我们使用RNAi技术获得了SlCMT4转基因沉默株系，并观察到一系列的表型变化，包括叶片变小、侧芽增加、果实小。同时，我们进一步采用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了SlCMT4突变株系，观察发现SlCMT4突变株产生严重的发育缺陷，包括叶片小而厚、侧芽增加、雄蕊和雌蕊缺陷、果实小且结实率降低以及种子发育缺陷。激素水平（IAA、tZR、srigol）的变化与SlCMT4突变植株中的多分枝的表型一致。CRISPR/Cas9介导的SlCMT4敲除诱导了两种花粉特异性基因（PMEI和PRALF）的表达，这两个基因具有抑制花粉壁和花粉管伸长发育的功能，这可能是导致花粉不规则和缺陷的原因。小果实表型可能与IMA基因表达上调以及突变株系中种子减少有关。此外，我们对果实进行了全基因组亚硫酸盐测序（WGBS），发现SlCMT4功能缺失降低了全基因组胞嘧啶甲基化水平。在SlCMT4突变体果实中，FW2.2和LOXB基因启动子的2-kp区域也观察到甲基化水平减少的现象，这表明CHH的高甲基化状态对于抑制IMA和LOXB启动子活性至关重要。综上，该研究阐明了SlCMT4在番茄营养和生殖器官发育中的功能和分子调控机制。