利用小分子RNA制备个体化诱导性多能干细胞(IPSCs)的研究

The current method in preparation of induced pluripotent stem cells (IPSCs) may cause genetic mutations, out of controlled expression, and low efficiency, which impose restriction on its clinical application. Nowadays, more and more researches focus on how to prepare IPSCs with small molecule compounds. However, the screening of traditional small molecule compounds has some limits, due to its randomness, targetlessness and complexity. Recent studies have shown that double-stranded microRNAs(miRNAs) can specifically increase the expression of its target gene, strongly and persistently. Accordingly, in our previous work, we designed and invented a methods for preparation of IPSCs by miRNAs. In this project, we intend to optimize and find out a series of miRNAs, which can specifically and efficiently upregulate stem cell core transcription factor genes, including SOX2, OCT4, KLF4, and so on, and to build up a method of preparing IPSCs using the small RNAs mentioned above. Furthermore, we will investigate the feasibility of applying this method to prepare patients' individualized IPSC from lung cells or blood nucleated cells. This project would provide a new way in preparing IPSCs by small molecule compounds and its clinical application.

利用小分子化合物制备IPSC是目前个体化干细胞研究领域中的热点，由于传统小分子化合物筛选随机性强、目标性差和工作量大，且现有制备诱导性多能干细胞(IPSC)的方法因可能引起基因突变、表达失控以及转化效率低等缺陷而制约其未来临床应用。双链小分子RNA具备可序列特异性地增强目标基因的表达水平、并且作用强烈与持续时间可的特点。据此，本课题组前期试验优化并筛选出可特异、高效诱导SOX2、OCT4、KLF4等干细胞核心转录因子基因上调表达的小分子RNA序列，并拟应用于建立诱导性多能干细胞的新方法，从而避免基因插入所致IPSC的基因突变与表达失控，并进一步探讨应用该方法从有核血细胞或上皮细胞制备患者个体化的诱导性多能干细胞的可行性。本项目利用小分子RNA调控干细胞核心转录因子表达用于诱导性多能干细胞，对未来IPSC的临床安全应用提供了一个新的研究思路。

近些年来，诱导性多能干细胞（IPSCs）的研究制备取得了突飞猛进的发展，从病毒方法到非病毒的转座子载体和蛋白质均能介导外源转录因子诱导产生IPSCs。但是利用病毒载体诱导IPS细胞时，会引起外源基因整合到体细胞基因组，引起插入突变而存在安全隐患。而转座系统将外源基因整合到细胞中诱导IPSCs后再将外源基因敲除，此方法效率虽高于病毒转染，但验证基因组不存在外源基因过程繁琐，且基因敲除后，转座酶识别点有基因重排的发生。因此，寻找一种高效安全制备诱导性多能干细胞的方法是干细胞研究的热点和难点。. 本项目基于前期研究结果，筛选优化出具有特殊结构并且可特异、高效、持续地诱导c-MYC、KLF4等目标基因（干细胞特异性表达基因）上调表达的功能小片段RNA分子。这类小分子化合物是针对c-MYC、KLF4等基因的5’非编码区启动子序列或转录起始位点及其侧翼序列，设计、合成并筛选出可诱导上述目标基因特异、高效上调表达的小片段RNA序列。我们最终确定基于目的基因KLF4的小分子RNA序列为KLF4-496和 KLF4-514，基于目的基因CMYC的小分子RNA序列为c-MYC-322和 c-MYC-787。实验结果显示，同一目标基因的候选小分子在不同细胞系中表达作用不同。其中ds-KLF4-496导入Caco2细胞中后目标基因的表达量最高，与对照组相比表达量高于5倍；而KLF4-514的小分子RNA在不同结肠癌细胞系中表达量无明显差异。为进一步探究小分子RNA在肿瘤细胞和正常细胞中的作用，我们将高表达的ds-KLF4-496转染到正常人胚胎肾脏细胞株HEK293中，结果显示ds-KLF4-496并不能促进HEK293细胞中KLF4基因的表达。由此可知，小分子RNA活化具有序列和细胞特异性，对于构建利用小分子RNA制备个体化诱导性干细胞具有重要意义。此外，我们构建了无异源人包皮成纤维-合成培养基的新型培养体系，与传统培养基相比，具有长期维持干细胞自我更新、多能性及无限增殖等优势，为干细胞的临床应用奠定了基础。. 综上所述，利用小分子RNA活化促进干细胞特异性基因高表达及培养条件的优化可长期、稳定的进行干细胞的诱导和培养工作，有效降低了病毒、生物大分子转染发生的基因突变及转染率低等问题，稳定了干细胞形态、增殖等特性，对干细胞的研究提供了新的途径。