玉米种子衰老过程中种胚mRNAs靶向性氧化研究

Seed aging is one of the significant theoretical problems unsolved in the field of seed biology so far. Many literatures have documented that the oxidative damage to functional proteins resulted from the reactive oxygen species (ROS) is an important cause for seed aging. However, whether the mRNAs oxidation occurred in embryo is associatied with the seed aging or not still remains unclear to our knowledge. In our previous study，there were more than 32000 mRNAs species found in the maize seed embyro and about 4700 species among them changed significantly after artificial aging treatment for 3d. It is significant to reveal the law of mRNAs oxidation for studying the molecular mechanism of seed deterioration. On the base of our previous study, four aspects would be investigated as follows: (1) Histochemistry technology will be used to examine the ROS production and their in situ locations; (2)Oxidized RNA immunoprecipitation and microarray hybridization on GeneChip Array will be done to identify the oxidated mRNAs species; (3) Dual-color fluorescence in situ hybridization（D-FISH）technology and 3-D image reconstruction technique will be performed to investigate the distriibution of oxidized mRNAs in different aged embryo cells. (4)Selective oxidized RNA damage ELISA, translation in vitro system and the 2-D electrophoresis technique will be used to assess their oxidative degree of mRNAs in the seed deterioration. All the works have been done would help us to uncover the law of mRNAs oxidation. This project could provide scientific data for elucidating the relationship between the targeted mRNAs oxidation and seed deterioration.

种子衰老是生物学领域迄今未解的重大理论问题之一。多数研究认为：由活性氧造成的蛋白氧化损伤是种子衰老的重要原因。而mRNAs氧化与种子衰老的关系如何迄今未见详细报道。本课题组研究发现，玉米种胚约有32000多种mRNAs，其中，有4700多种经人工老化处理3天后发生显著差异变化。揭示这些mRNAs的氧化规律对研究种子劣变的分子机理具有重要意义。因此，本研究拟在前期工作基础上，用组织化学方法研究ROS亚细胞定位；用氧化RNA的免疫共沉淀和芯片杂交技术相结研究种胚mRNAs氧化种类；用双色荧光原杂交技术和图像三维重建技术相结合研究氧化mRNAs在细胞的分布；用选择性RNA氧化损伤的酶联免疫技术、体外翻译实验和双向电泳技术相结合研究不同老化种胚mRNAs氧化程度。开展上述研究有助于揭示种胚mRNAs氧化规律，能够为研究种胚mRNAs靶向性氧化与种子劣变的关系提供科学依据。

种子衰老是生物学领域迄今未解的重大理论问题之一。已有研究认为：由活性氧造成的细胞结构破坏、功能蛋白修饰、DNA双链断裂是种子衰老的重要原因。然而，活性氧造成的mRNAs氧化与种子衰老的关系如何迄今尚不清楚。.本项目分别以“自然老化”（1年、3年）、平衡水分处理（4个月）、“人工老化”（1d、2d、3d、4d、5d）的玉米杂交种郑单958品种种子为材料，用标准发芽实验和TTC染色方法评价不同条件下贮藏的种子活力表现，结果表明，含水量超过临界水分（12.5-13.0%）的种子，其活力随着贮藏时间延长而快速下降，表明种子含水量是影响种子活力的重要因素。.采用组织化学染色（NBT、DAB）方法，借助光镜和电镜手段，研究衰老玉米种胚中ROS（超氧阴离子和过氧化氢）产生及其分布，结果表明，种胚中ROS产生和积累具有明显的器官差异性，其中胚根分布比较集中，胚芽、胚轴、盾片次之。H2O2主要集中分布在种胚不同器官的细胞壁中，且随人工老化处理时间延长而加重。.采用免疫沉淀技术获取衰老种胚氧化的 mRNAs并进行芯片杂交实验。结果表明，对照组种胚中发生差异表达氧化mRNA有642种，人工老化处理1d后检测到差异表达的氧化mRNA有594种。其中有373种“已氧化mRNA被修复”，有325种“新氧化mRNA”，同时还有269种“持续氧化mRNA”。KEGG和GO分析表明，这些氧化的mRNA主要涉及到能量代谢（线粒体相关）、蛋白质合成（核糖体相关）、信号转导等功能。这些mRNA的氧化可能是种子衰老的重要原因。.利用原位杂交和qRT-PCR技术研究部分能量代谢和蛋白合成相关的氧化mRNAs分布，结果表明，这些氧化的mRNAs在衰老玉米种胚中的分布存在器官差异性，它们主要分布种胚的胚根中。这些mRNAs氧化不是随机的，而是具有选择性。.利用HPLC技术、反转录阻断技术和iTRAQ技术评价了不同劣变种胚mRNAs氧化损伤程度，结果表明，随着种子贮藏或老化程度不断加深，8-OHG 含量不断增高，能量代谢、蛋白合成、响应胁迫、信号转导等相关蛋白mRNA完整性下降（R值降低）。衰老玉米种子种胚中能量代谢和蛋白代谢等相关蛋白的选择性下调差异表达，这也暗示种胚mRNAs可能存在一定的氧化损伤。.本研究初步构建了基于mRNAs 靶向性氧化所导致的玉米种子衰老机理模型，为揭示种子衰老分子机理提供了科学依据。