肌质网和线粒体钙库释放条件下STIM1对血管张力的调节作用

Sarcoplasmic reticulum (SR) and mitochondria are two important Ca2+-storing organelles (Ca2+ stores) in smooth muscle cells. STIM1 is an important Ca2+-sensing protein at the SR. Massive Ca2+ release form the SR leads clustering of STIM1 at the SR-plasma membrane (PM) junctions. These STIM1 clusters activate the Ca2+ channel Orai at the PM and meanwhile inhibit Cav1.2, the major voltage-gated Ca2+ channel in smooth muscle. Our previous study found that Ca2+ release from mitochondria resulted in intracellular clustering of STIM1 and inhibited its translocation to the PM, and thus abolished its ability to modulate the Ca2+ chnanels at the PM. Considering the distinct effects of SR and mitochondrial Ca2+ release on the subcellular localization of STIM1, and that STIM1 can directly inhibit the vascular constriction-triggering channel Cav1.2, we suppose that these two forms of Ca2+ release have opposite effects on the regulation of vascular tone. Experiments including vascular tension measurement, whole-cell current recordings, fluorescent protein localization in live cells, intracellular global Ca2+ level and Ca2+ spark recordings will be carried out to investigate this hypothesis and explore the underlying molecular mechanisms. Clarifying the regulatory mechanism of Ca2+ store release on vascular constriction and relaxation will provide novel insight and experimental evidence for studies on the pathological mechanism of hypertension.

肌质网和线粒体是平滑肌细胞中两种主要的钙贮存细胞器（钙库）。STIM1是肌质网上重要的钙感受蛋白，肌质网的钙大量释放后STIM1会聚集到肌质网-细胞膜连接处，激活细胞膜上的钙通道Orai并同时抑制平滑肌中主要的电压依赖性钙通道Cav1.2。本课题的前期研究发现线粒体的钙释放可以引起STIM1在胞内的聚集并抑制其向细胞膜的移动，从而失去调控细胞膜上钙通道的能力。鉴于肌质网和线粒体的钙释放对STIM1的胞内定位有着截然不同的作用，而STIM1又可以直接抑制引发血管收缩的Cav1.2通道，本课题认为这两种形式的钙释放很可能对血管张力有着相反的调节作用，并将通过血管张力测量、全细胞电流记录、活细胞蛋白荧光定位、细胞内整体钙水平和钙火花记录等实验对这个假设进行验证并对其分子机制进行研究。明确钙库释放对血管舒缩的调节机制将为研究高血压的发病机制提供新的思路和实验证据。

本项目致力于研究平滑肌细胞肌浆网中的钙感受蛋白STIM1对细胞膜上钙库操纵的钙通道Orai1和电压门控的L型钙通道Cav1.2的调控作用，以及这些调控机制对血管张力的影响。根据前期文献报道，肌浆网钙库释放后STIM1会聚集到肌浆网-细胞膜连接处，激活Orai1通道并同时抑制L型钙通道活动。利用活细胞荧光蛋白标记和全内反射荧光显微技术，本研究进一步确认了STIM1和Orai1的相互结合，但是并未发现STIM1和Cav1.2之间的共定位。为了在整体动物水平上对STIM1/Orai1在血管平滑肌中的生理作用进行研究，本课题构建了整合Orai1突变体的转基因小鼠，并从国外引进了平滑肌特异性的Cre小鼠，两种小鼠杂交后可以实现Orai1突变体在平滑肌细胞中的特异性高水平表达，从而完全抑制内源性Orai1/2/3通道的功能。现在两种转基因小鼠的品系已经稳定建立，正在对杂交后代进行基因分型和功能研究。利用转基因小鼠，本项目还对STIM1/Orai1在其它组织器官中的功能进行了探索，发现STIM1/Orai1在肾脏近曲小管对白蛋白的重吸收过程中起着至关重要的调节作用，研究论文已投稿Nature Communications并完成了审稿人要求补充的实验，很有可能在上半年被接受发表（本项目负责人为第一作者）。在血管平滑肌方面，本项目已发表两项研究结果：①细菌内毒素（脂多糖）对内皮素引发的平滑肌收缩没有明显影响，但是可以显著促进内皮素刺激的平滑肌细胞增殖，其机制主要是通过上调TRPC离子通道的表达来实现的。②结直肠癌病人肠系膜血管平滑肌中的线粒体DNA普遍存在约5kb的片段缺失，缺陷DNA的含量明显高于正常对照。截至2017年2月，本项目负责人已以第一作者或通讯作者身份发表由本项目资助的SCI研究论文4篇，单篇最高影响因子5.1。