根腐线虫诱导的苎麻基因表达谱研究及抗性相关基因的克隆

Ramie is a kind of textile crop with excellent fiber quality; It also has high application values and potential in medicine, forage and water and soil protection. Root lesion disease caused primarily by Pratylenchus coffeae, resulted in severe yield loss and quality decrease of ramie. Additionally, lack of knowledge of mechanism of ramie resistant to nematode, restricted the efficient use of resistant recourses and genetic improvement for nematode resistance of ramie. Therefor, a resistant ramie and P. coffeae interaction system was used as materials in this project, and differential expressed gene mRNA tags induced by P. coffeae in ramie will be generated by digital gene expression profiling (DGE) analysis. Additionally, high-throughput sequencing（454 GS FLX）will also be applied to generate whole transcriptome profiling of the uninoculated ramie roots. By comparing data generated by DGE and that of 454 GS FLX, differential expressed genes and networks will be analyzed. Temporal and special expression character of these genes and signal pathways they may be involved will be revealed by real-time quantitative PCR and RNA in situ hybridization. Candidate nematode resistance related genes will be picked out based on these data, and the full length cDNAs will be synthesized by RACE technology. The results of these studies will not only provide some gene resources for improve the ramie resistant nematode, but also be helpful to insight the molecular mechanism of ramie resistant nematode.

苎麻是纤维品质优良的纺织作物，其在饲料、医药及水土保持方面也有很高的应用价值和潜能。咖啡短体线虫为主要病原引起的根腐线虫病，严重影响苎麻产量和品质。苎麻抗线虫分子机制研究的欠缺，制约了抗性资源的高效利用及抗线虫遗传改良。为此，本项目以抗根腐线虫苎麻材料与咖啡短体线虫互作体系为研究对象，利用数字基因表达谱（digital gene expression profile，DGE）测序技术分析根腐线虫诱导的苎麻差异表达mRNA标签；同时，以通过高通量（454 GS FLX)测序的未接种样品全转录组信息为对照，分析差异表达基因特征和网络。借助qRT-PCR和RNA原位杂交分析，验证并阐明候选抗性基因在线虫侵染过程中的表达特征、可能参与的信号通路。筛选抗线虫候选基因，利用RACE技术获得候选基因全长cDNA。项目研究结果将为苎麻抗线虫遗传改良提供基因资源，为深入解析苎麻抗线虫的分子机理奠定理论基础。

苎麻（Boehmeria nivea L.）是荨麻科多年生宿根草本植物，也是优良的纤维作物、饲料作物。咖啡短体线虫引起的根腐线虫病是严重制约苎麻生产的重要土传病害，被称为苎麻的“癌症”。长期以来，该病的防治主要依赖化学药剂，带来严重的环境及生态问题。同时，苎麻育种学家主要以产量和品质为主要育种目标，生产上推广的高产品种抗性均不高，缺乏高产高抗的优良品种。此外，苎麻抗根腐线虫相关机制不清楚，制约了抗性材料的高效利用和抗性品种的选育。本项目以高抗根腐线虫材料（青大叶）和咖啡短体线虫互作体系为研究对象，采用高通量测序研究根腐线虫诱导的苎麻转录组变化、差异基因表达及调控网络；并采用qPCR研究线虫诱导后差异基因的在抗、感品种中的表达特征，分析明确抗性相关基因；克隆抗性相关基因并研究表达产物生化性质。项目已经开展的工作中，利用转录组测序分析青大叶根样品，获得4.68Gb数据（23M reads），de novo组装获得40826条unigenes。利用NR、SwissProt、KEGG、COG、GO数据库比对分析，获得26884条Unigenes注释。采用表达谱测序对线虫诱导（CH）、未诱导（CK）苎麻根样品进行了测序，分别获得8M、10M数据量，测序达到饱和；比较转录组分析检测到137个差异表达基因，117个上调，20个下调表达。采用定量PCR技术分析发现，线虫诱导后，半胱氨酸蛋白酶抑制剂（BnCPI）、几丁质酶（BnCHI）、过氧化物酶(BnPOD)等基因在抗、感材料中的呈现不同表达模式，这些基因及表达产物可能与抗病性密切有关。采用RACE技术获得BnCPI、BnCHI、脂氧化酶基因（BnLOX）等基因全长，分析了基因分子特征，将基因导入原核表达系统（BL21），将进一步进行表达、纯化、以及生化和抑菌活性分析。这些研究结果可为苎麻分子生物学分析和抗性研究提供基础。