番茄SlBL4基因调控果实发育和成熟的机理研究

The transcription factors homeobox (HB) play important roles in the regulation of growth and development in eukaryotes. The BELL family, which is one sub gene family of the homeobox, were found in all terrestrial plants. In the previously study, SlBL4 gene were cloned. The RNAi constuction of SlBL4 resulted in dark green colour and accumulated more chlorophyll content of immature fruit but the colour of the RNAi fruit is salmon pink and uniform compared with wild type fruit at the red stage. These results exhibit the potential function of SlBL4 in fruit pigment and ripening in tomato fruit. In this project, anatomic analysis and high-throughput sequencing will be applied to compare the anatomical structure and transcriptional differences between SlBL4 transgenetic tomato and wild type tomato during fruit formation. Immunoprecipitation-Sequencing (ChIP-Seq) and Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) will be employed to identify the target genes of SlBL4. The results will help to dissect the molecular mechanisms of SlBL4 gene which regulates fruit development and ripening, and providing potential candidate genes for improving tomato quality by genetic engineering technology.

同源异型盒基因编码具有同源异型盒结构域的蛋白，是一类重要转录调控因子，在真核生物生长发育过程中发挥着重要调控作用。BELL家族是同源异形盒转录因子的一类，存在于所有陆生植物中。本项目在前期研究中分离了BELL家族中的SlBL4，干扰SlBL4后，发现番茄果实在未成熟阶段积累较多叶绿素、幼果深绿，而破色后转基因番茄果实呈橙红色且着色不均，结果说明SlBL4可能参与了果实色素形成和调控果实成熟。因此，本项目拟通过组织切片和RNA-seq技术研究野生型番茄与SlBL4转基因番茄（包括干扰和超表达株系）果实形成过程中显微结构和基因表达谱的差异，并利用ChIP-Seq和EMSA技术深入分析SlBL4调控的靶基因，明确其调控途径及机理。研究结果不仅可以揭示SlBL4调控番茄果实发育和成熟的信号网络，同时也可为利用基因工程技术进行果实类作物品种改良提供新的基因资源。

番茄是一种重要经济作物，也是研究果实的一种模式植物。果实发育调控的分子机制是一个复杂而有序的过程。叶绿体是植物光合作用的场所，而叶绿素则是植物进行光合作用的主要色素。光合作用为番茄果实生长发育提供能量和碳水化合物；番茄果实碳水化合物的种类和含量，直接影响果实的品质。番茄果实成熟软化与细胞壁的降解过程密不可分，植物细胞壁结构对于保护原生质体和维持器官与植株的固有形态具有重要的作用。番茄BELL亚家族对于调控叶绿体发育和细胞壁降解的调控机制仍不清晰；因此，深入研究BELL亚家族的转录调控机理将有助于阐明其在番茄果实叶绿体发育及其细胞壁降解调控过程具有重要的理论意义。本研究采用RNAi干扰技术、转录组测序（RNA-Seq）、染色质免疫共沉淀技术（ChIP-seq）及其它研究方法，分析SlBL4调控番茄叶绿体和细胞壁发育的分子机制，主要结论如下：.1、以番茄（Micro-Tom）RNAi转基因植株为材料，研究发现转基因番茄果实颜色变深，叶绿素含量提高且叶绿体中类囊体片层结构增多；果实变软且细胞壁间隙增大；表明S1BL4调控叶绿素的积累、叶绿体的发育和细胞壁的降解过程；.2、采用RNA-Seq分析转基因番茄与对照组番茄，不同时期果实中差异表达基因，发现这些基因主要参与与叶绿体发育、叶绿素代谢、类胡萝卜素代谢和细胞壁代谢等；.3、采用ChIP-seq筛选到1875个SlBL4 靶标基因，主要包括三类motif，即 TGGGC（C/T），（G/A）GCCCA（A/T/C）和（C/A/T）（C/A/T）AAAAA（G/A/T）（G/A）。 通过对RNA-Seq 和 ChIP-seq 的数据分析，发现共有 420 重叠基因，主要包括以下几个基因SlPPO， SlCHLD， SlCAB-3B， SlPE 和 LeSPL-CNR等。进一步利用EMSA体外实验验证，表明SlBL4 直接抑制SlPPO， SlCHLD， SlPOR，CABs 和TKN2的表达来调控叶绿体的发育。SlBL4 直接抑制SlPE或激活 LeSPL-CNR 来调控细胞壁的降解。.综上所述，本研究明确了SlBL4在番茄果实生长发育和成熟的转录调控机制，为深入阐明果实发育和成熟调控通路奠定了基础。