p130cas通过促进自噬导致非小细胞肺癌放射敏感性降低的分子机制研究

The relationship and mechanism between enhanced autophagic activity appeared in the course of radiotherapy and radiosensitivity are controversial. A most recent study found that p130cas effected on both autophagy and tumor treatment sensitivity, but the underlying mechanisms remain unclear. Moreover, there were no relevant reports about the effect of irradiaion on p130cas expression and the relationship between ionizing radiation and autophagy. Our results showed that the irradiation can increase the expression of p130cas and phosphorylation levels, enhance the expression of autophagy marker LC3B and decrease the radiosensitivity of lung cancer cells. We hypothesized that p130cas may activate JNK through phosphorylated the No. 6-15 tyrosine phosphorylation sites at its substrate region, and then directly activated DRAM gene or facilitated the depolymerization between Beclin-1 and Bcl-2 by phosphorylated Bcl-2, which thus enhanced autophagic activity and reduce the radiation sensitivity. We intend to bidirectional regulation of p130cas/JNK pathway, constructing p130cas different domain and different phosphorylation site mutants. The aims of our study were to elucidate the relationship and mechanism between autophagy and radiosensitivity of lung cancer cells and to provide important theoretical and experimental basis for radiotherapy sensitization and radiation resistance prevention.

放射治疗过程中出现的自噬活性增强与放射敏感性之间的关系和机制备受争议。最新的研究发现p130cas对自噬和肿瘤治疗敏感性均有调节作用，但机制尚不十分清楚，在肺癌中照射对p130cas的影响及与自噬的关系尚无相关报道。我们发现照射可以上调p130cas的表达和磷酸化水平，增强自噬标记物LC3B的表达，降低肺癌细胞的放射敏感性。因此推测p130cas可能通过底物区域第6-15位酪氨酸磷酸化，调控JNK激活和DRAM基因转录，或使Bcl-2发生磷酸化，促使Beclin-1与Bcl-2解聚，从而增强自噬活性，降低放射敏感性。我们拟通过双向调控p130cas/JNK通路、构建p130cas不同结构域及不同磷酸化位点的突变体等方法，试图阐明肺癌中自噬与放射敏感性之间的关系及分子机制，为临床上放射治疗增敏和避免放射抵抗提供重要理论基础和实验依据。

非小细胞肺癌在放射治疗过程中的放射抗拒现象是影响患者疗效的重要原因，本研究拟通过研究p130cas调控非小细胞肺癌放射敏感性的分子机制，力图寻找放射增敏的新靶点。我们发现过表达p130cas后，无论在体外还是体内，都表现出更强的放射抗拒能力。Western Blot结果显示在这一过程中，细胞的自噬水平上调。随即，我们发现，与对照组相比，在过表达p130cas的细胞系中，FAK/SRC信号通路的磷酸化水平显著上调，同时，Hippo通路中LATS-1和YAP的磷酸化水平明显下调。在核浆分离后，我们发现细胞核内的YAP表达水平明显增加，说明p130cas能够促进YAP入核。因此，我们进一步通过qPCR的方法检测了YAP下游转录因子CTGF和CYR61的mRNA水平，发现二者表达均有明显上调。接下来，我们在过表达p130cas的细胞系中加入FAK的特异性抑制剂PF562271，western blot结果显示，不仅仅过表达p130cas所引起的FAK/SRC磷酸化被逆转，其所引起的核内YAP表达增加以及CTGF表达增加均被逆转。为了阐明p130cas是否通过FAK/SRC通路调节YAP入核，我们设计合成了p130cas不同结构域缺失的截短突变体，在稳定转染各个不同突变体质粒后，无论是切除SH3结构域，C端结构域还是底物结合结构域均可以减弱p130cas所引起的FAK/SRC磷酸化水平升高以及YAP入核增加。我们还发现过表达p130cas全长序列还可以降低DNA损伤修复通路中ATR/ATM的磷酸化，而上述三种截短突变体则不具备这样的功能。在接受照射后，与对照组相比，过表达p130cas的细胞系中ATM/ATR的磷酸化水平明显降低，而核内的YAP表达则明显升高，表现出显著的放疗抗拒现象。当向过表达p130cas的细胞系中加入YAP特异性抑制剂VP后，可以观察到过表达p130cas所引起的核内YAP表达增加被逆转，同时在照射后3小时开始，ATM/ATR的磷酸化水平再次升高，说明细胞的放射敏感性增加。综上所述，我们的结果显示，p130cas可能通过磷酸化激活FAK/SRC信号通路，进而促进YAP入核并激活其下游靶基因CTGF和CYR61，进而导致非小细胞肺癌的放射抗拒现象。本研究结果加深了对p130cas导致放射抗拒这一现象的认识，丰富和完善了对肺癌中FAK/YAP信号通路影响放射