利用单细胞测序技术研究小分子化合物诱导成纤维细胞转分化为心肌细胞的作用机制

Cardiac regeneration research brings hope for the treatment of human heart diseases, and generation of mature cardiomyocytes by cell transdifferentiation or cell differentiation has become a hot research field. Our previous study indicates that only using four to six kinds of small-molecule compounds is sufficient to induce transdifferentiation of mouse fibroblasts into cardiomyocytes. In addition we found that some cardiac precursor cells appeared in the process of transdifferentiation, but without induced pluripotent stem cells (iPSCs) appeared. The transdifferentiation process bypasses an induced pluripotent stage. However, some issues are still not very clear, such as how fibroblasts dedifferentiate to precursor cells and differentiate into cardiomyocytes by compounds. This study will apply single-cell RNA sequencing technology to monitor gene expression dynamic change in the process of fibroblasts transdifferentiating into cardiomyocytes by small-molecule compounds and find the key genes. We will further explore the roles of the compounds used in the transdifferentiation of fibroblasts into cardiomyocytes. This study will provide a new vision for the treatment of cardiac diseases.

心脏再生研究为治疗人类心脏疾病带来希望，而诱导其他类型细胞转分化或分化形成成熟的心肌细胞是心脏发育与再生研究中的重要命题。前期研究首次发现仅需4-6个小分子化合物的组合，就能诱导小鼠成纤维细胞转分化为心肌细胞。上述诱导过程中形成了部分心脏前体细胞，且无诱导多能性干细胞（iPSCs）产生，这提示成纤维细胞转分化为心肌细胞的过程中并未经历多能性状态。然而，多种小分子化合物是如何改变成纤维细胞性状使其去分化并进一步分化为心肌细胞目前尚不明。拟应用单细胞RNA测序技术研究小分子化合物诱导小鼠成纤维细胞向心肌细胞转分化过程中基因表达动态变化，找到转分化过程中的关键基因，探索小分子化合物诱导小鼠成纤维细胞转分化为心肌细胞的作用机制，旨在为心脏病的临床治疗提供一种有前景的新视角。

小分子化合物化合物剂量可控，安全可靠，在体细胞重编程及转分化中发挥着重要作用。我们前期研究发现使用CHIR99021、Repsox、Forskolin、VPA、Parnate和TTNPB六种小分子化合物的化学鸡尾酒组合（CRFVPT），可以在体外实现小鼠胚胎和尾尖成纤维细胞向心肌细胞的转分化。这些化学诱导获得的心肌样细胞（chemical induced cardiomyocytes，CiCMs）可以表达心肌特异性的基因，并拥有心肌类似的电生理特征（Cell Research，2015）。本项目进一步筛选小分子化合物提高转分化诱导效率，并将小分子化合物应用于小鼠体内，优化给药剂量，促进心梗小鼠的机体恢复。我们发现，CHIR99021、RepSox、Forskolin和VPA（CRFV）是CiCMs诱导的四个核心化合物，仅通过这四种小分子化合物也能诱导出少量心肌样细胞。其中，RepSox发挥了最重要的作用。撤去单一化合物实验显示，撤去RepSox将完全无法诱导出自发收缩的细胞；加单一化合物实验显示，RepSox诱导体系内还先后产生了大量脂肪细胞与神经样细胞。我们应用单细胞RNA测序技术分析了关键化合物RepSox在诱导小鼠成纤维细胞转分化过程中细胞内的基因表达动态变化，进一步探索了该化合物的作用机制。此外，我们还通过单细胞测序技术分析了冠心病与先天性心脏病病人的右心耳细胞，研究人类心脏细胞在病理条件下的组分差异。我们的研究工作为小分子化合物的临床应用提供了一定的理论支持。