泛素连接酶与桑脉带相关病毒N蛋白相互作用机制研究

Ubiquitin ligases（E3），which are the key components of ubiquitin proteasome system(UPS), play crucial roles in plant-virus interactions and defense responses to pathogens. Mulberry vein banding-associated virus (MVBaV) is a major pathogen of mulberry virus disease. In the previous research, the transcriptome analysis showed significant difference of E3 genes expression level. Meanwhile, a kind of E3 protein was identified as potential interacting host protein of the N protein using co-immunoprecipitation method. The interaction between E3 protein and N protein was suggested which may involve in the pathogenic process of the MVBaV. In this study, the N proteins of MVBaV will be used as a bait to screen the interacting proteins of E3. The biochemical activity, expression profiles and subcellular localization will be analyzed. Furthermore，the E3 gene RNAi and overexpressing transgenic lines of mulberry will be generated and disease phenotype of these transgenic lines against MVBaV will be studied. This study will provide the direct evidence for the E3 protein functions in the pathogenic process of the MVBaV, and also lays a solid foundation for future studies of the resistant mechanism of mulberry again MVBaV and provide new strategies for crop protection.

泛素连接酶（E3）是泛素蛋白酶体系统(UPS)的重要组成部分，在植物-病毒互作及植物抗病反应中起关键调节作用。桑脉带相关病毒(MVBaV)是桑树病毒病的主要病原之一。前期研究中，我们进行了MVBaV侵染桑树的转录组学研究，发现多个E3基因的表达量有显著差异；同时还发现E3与MVBaV的核外壳蛋白（N）有免疫共沉淀反应发生，推测E3与MVBaV的N蛋白相互作用，并在其致病过程中起重要作用。本研究在筛选、鉴定与MVBaV N蛋白互作的E3的基础上，研究互作E3蛋白生化活性、表达模式及其亚细胞定位；同时构建E3基因RNAi和过量表达转基因桑，研究E3基因在病毒复制及病害症状表现中的作用。研究结果将为E3蛋白在MVBaV致病过程中的作用机制提供直接证据，同时也为今后桑树抗病机制及防治研究奠定基础。

泛素连接酶（E3）在植物-病毒互作及植物抗病反应中起关键调节作用。桑脉带相关病毒(MVBaV)是桑树病毒病的主要病原之一。前期研究中，我们进行了MVBaV侵染桑树的转录组学研究，发现多个E3基因的表达量有显著差异；利用免疫共沉淀筛选到一个可能与MVBaV 核外壳蛋白（N蛋白）互作的桑树蛋白，该蛋白具有典型的泛素连接酶活性结构域，将之命名为桑树假定的泛素连接酶（MaPE3）。项目研究采用荧光定量PCR进行检测，明确了MVBaV可以诱导MaPE3表达。在此基础上，克隆了MaPE3全长cDNA序列，采用酵母双杂交系统和双分子双荧光互补进行MaPE3蛋白与MVBaV N蛋白相互作用研究，研究了MaPE3的表达模式。研究结果显示，MaPE3包含246个氨基酸，是一种可溶性蛋白，不具备跨膜结构域，可能定位于细胞质、细胞核和叶绿体。酵母双杂交系统和双分子双荧光互补分析结果均显示MaPE3与MVBaV N蛋白存在相互作用；MaPE3基因在叶片中的表达量最高，分别为茎和根的3.17倍和2.25倍；经100 μmol/L的水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸和乙烯等外源激素处理后，MaPE3在叶片中的表达量均明显降低；在高温、低温、高盐、干旱和损伤胁迫下，MaPE3的表达量也显著下降。此外，本项目还进行MVBaV N蛋白原核表达及多克隆抗体的制备，并建立MVBaV的快速检测体系。将MVBaV N基因连接到pET-30a表达载体上，经IPTG诱导可在大肠杆菌菌株BL21（DE3）中表达，产生分子量约36.0 kDa的融合蛋白；制备的N蛋白多克隆抗体效价为1:256 000，具有良好的特异性和较高的灵敏度；建立了MVBaV的RT-LAMP检测方法，该方法能在恒温条件（63℃）下，1 h内检测出MVBaV，其灵敏度是RT-PCR检测方法的10倍。本项目研究结果为进一步进行MaPE3的功能研究及其与N蛋白互作机制研究奠定了基础。