利用DNA shuffling创制植物新型强耐盐碱基因及其分子调控机理研究

Soil salinization is an important abiotic stress factors with serious impact on plant growth and crop yield. Soil, with high concentrations of Na + would seriously disrupt the normal metabolism of plants. Previous studies have shown that one of the most effective strategies of plants to withstand salt stress is to adjust the ion balance of the plants through the Na + / H + antiporter. Therefore, the use of transgenic technology will have a highly impact plant salt tolerance by Na + / H + antiporter gene (NHX1, NHA1) activity and their transformation to breed new lines for salt-tolerant plants in the crop is of great significance for agricultural production. This study will focus on looking for the salinity tolerant plants of the saline tidal flat soils of about 2.5% to 4.0% salt content (Suaeda, Salicornia, English cordgrass, Alkali grass), from which to isolate and clone salt tolerance gene, and use DNA shuffling and other directed evolution methods to get high salt tolerance NHX1, NHA1 gene. Eventually, these new created gene will be transferred to the model plant Arabidopsis. Furthermore we will also study the transcript expression profile differences to analyze the transcriptional regulatory network of the key control unit. At last,we will analyze the impact of micro-regulation of other metabolic pathways (ABA pathway), signal transduction pathways, holistic approach to the reorganization of the new strong salinity of Na + / H + transporter gene molecular regulation mechanism.

土壤盐渍化是严重影响植物生长发育和农作物产量的重要非生物胁迫因素。土壤中高浓度的Na+会严重扰乱植物的正常代谢。研究表明，植物抵御盐胁迫的最有效的策略之一是通过Na+/H+逆向转运蛋白来调节植物体内的离子均衡。因此，利用转基因技术将具有高度耐盐性的Na+/H+逆向转运蛋白基因（NHX1，NHA1）转入到作物中培育出耐盐植物新材料对于农业生产具有重大意义。本研究通过寻找盐碱滩涂地的耐盐碱植物（耐盐幅度高达2.5%～4.0%）碱蓬、盐角草、大米草、星星草，分离克隆耐盐基因，并利用DNA shuffling 定向进化方法改造得到高耐盐性的NHX1、NHA1新基因，利用强耐盐改组新型基因转化拟南芥，分析苗期盐胁迫响应转录本表达谱差异及转录调控网络的关键控制单元，分析其对其他代谢途径（ABA途径）、信号传导途径的微调控影响，系统全面地探讨新型强耐盐碱改组Na+/H+转运蛋白基因的分子调控机理。

本项目研究以植物耐盐性为出发点，选择目前植物耐盐性研究领域最热点的Na+/H+逆向转运蛋白基因（NHX1）作为研究对象。克隆得到了碱蓬、盐角草等盐生植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因，利用分子进化手段DNA family shuffling技术，对该基因进行了多次“洗牌”；采用酵母双缺陷型菌株AXT3构建了高通量筛选文库，获得了正向进化的Na+/H+逆向转运蛋白基因，并命名为SseNHX1。. 对SseNHX1基因进行了2D结构预测，得到了其跨膜结构域，初步分析了其在耐盐方面的功能；同时也进行了3D结构预测，鉴定了改组后SseNHX1的关键突变位点及空间分布，研究了这些突变位点对整个蛋白活性的影响；进而以具有高耐盐性的新基因以及碱蓬与盐角草的Na+/H+逆向转运蛋白基因为目标基因，进行了酵母转化及模式植物烟草转化，对改组后的基因功能及其耐盐机理等进行了全面的研究与分析。从分子及生理等多个角度，系统且全面的探讨了新型耐盐基因的重要分子调控机理，有助于阐明植物在应答盐胁迫等逆境时，信号的传导、代谢调控等的复杂网络机制。. 本研究按照项目书内容，全面完成了项目指标，共发表中英文论文七篇，其中，SCI论文四篇，中文核心期刊三篇。授权发明专利一项。本研究成果亦可应用于盐渍化土壤的生物修复，植物耐盐性的改良，提高作物产量，为培育植物耐盐新品种提供了新的遗传材料。在全球土壤盐渍化严重，未来人口增加，可使用耕地面积减少的情况下，本研究成果具有重大的科学意义和潜在应用价值。