HO-1对低氧状态下脐血间充质干细胞成骨分化的调控及机制研究

Mesenchymal stromal cells are a pluripotent cell population capable of differentiating into osteoblasts.Cell therapy using MSCs represents a promising approach to promote wound healing and tissue regeneration. The physiologic oxygen partial pressure in the human body is much lower than the atmosphere, ranging from 1% in cartilage and 1-7% in bone marrow to 10-13% in arteries, lungs, and liver. in the ex vivo culture system, the oxygen concentration is almost 21% which is much higher than the physiologic oxygen partial pressure in the body.Several studies have been carried out in order to analyze the effects of hypoxia on MSCs, but the results were either inconsistent or yielded conflicting results.One key event in the cellular adaptation towards a hypoxic environment is the induction/stabilization of Heme oxygenase-1.We have previously shown that HO-1 expression is a portal to increased osteoblast stem celldifferentiation. Based on these findings, we hypothesize that hypoxia may increase the osteogenesis of MSC. To test this hypothesis, we developed original MSC derived from cord blood.Using human MSCs, we first discussed the effects of hypoxia on the osteoblast differentiation of MSCs.The we foucused the role of HO-1 in the osteoblast differentiation of MSCs under hypoxia.At last, we discussed the mechanical mechanism that regulating the osteoblast differentiation of MSCs.This study will provide further insight into the understanding of bone tissue engineerying.

间充质干细胞具有成骨分化潜能，通常被用作骨组织工程的种子细胞。MSC体外增殖分化研究通常是在20% O2的条件下，然而体内MSCs的主要积聚部位骨髓的氧浓度为1%-7%。因此，有必要研究低氧对干细胞成骨分化的影响并探讨其机制。细胞为适应低氧环境，自身会上调某些分子的表达如血红素单加氧酶-1。我们既往研究发现HO-1在常氧培养条件下能促进MSC成骨分化，据此提出假说：低氧环境能促进MSC高表达HO-1，进而促进MSC成骨分化。为了验证这一假说，我们原代培养脐血来源MSC，分别于常氧和低氧条件下进行成骨诱导，采用Realtime PCR、Western blot、RNA干扰等手段，从细胞及分子水平多层次明确低氧对MSC成骨分化的影响；探讨HO-1对低氧状态下MSC成骨分化的影响，揭示低氧条件下，HO-1调控MSC成骨分化的分子机制，以期为骨组织工程种子细胞研究提供新思路。

间充质干细胞具有多能分化潜能，能分化为骨、软骨和脂肪组织，被视为理想的骨组织工程细胞。传统的间充质干细胞体外增殖分化研究通常是在20%的常氧条件下进行。然而体内间充质干细胞通常积聚于低氧环境中（1-15%），因此，研究低氧对间充质干细胞成骨分化的影响并探讨其机制，将是研究骨组织工程的关键。血红素单加氧酶-1( Heme oxygenase-1, HO-1)是血红素代谢途径中的限速酶，对间充质干细胞的成骨分化具有调控作用。本项目旨在探讨缺氧对人间充质干细胞成骨分化的影响，并进而分析血红素单加氧酶-1在低氧状态下对间充质干细胞成骨分化的调控作用。我们分离培养人间充质干细胞，在体外采用低氧条件（5% O2）培养。结果发现，低氧培养能维持间充质干细胞的表型和形态，促进间充质干细胞增殖及干性基因的表达，同时对间充质干细胞的凋亡没有明显影响；在低氧条件下，成骨诱导14天后，成骨相关因子表达明显提高；成骨诱导28天后，胞内碱性磷酸酶的表达及茜素红染色也明显增强。以上结果表明，低氧能促进间充质干细胞成骨分化。进一步分析低氧状态下间充质干细胞成骨分化的调控因素，我们发现，血红素单加氧酶-1在成骨培养第6天和第10天增高。结果提示血红素单加氧酶-1可能参与低氧状态下间充质干细胞的成骨分化。在此基础上，成骨培养过程中加入血红素单加氧酶-1的诱导剂CoPP和抑制剂ZnPP后发现，CoPP能促进成骨基因 OCN, ALP 以及COL1A1的表达；与之相反，ZnPP能抑制OCN, ALP 以及COL1A1的表达。提示血红素单加氧酶-1可能是调控间充质干细胞成骨分化的关键因子。同时发现，CoPP能促进碱性磷酸酶染色及茜素红染色。进一步研究发现血红素单加氧酶-1能上调间充质干细胞eNOS的表达。我们的结果表明，低氧状态下，血红素单加氧酶-1是调控间充质干细胞成骨分化的关键因子，其功能与信号通路分子eNOS有关。这一成果，对于间充质干细胞的分化调控，以及临床骨组织工程研究具有重要指导意义。