纤毛原生动物减数分裂产物凋亡机制的研究

在尾草履虫等纤毛虫的接合生殖过程中，小核通过减数分裂产生单倍体核，其中只有1核再进行一次有丝分裂形成迁移原核和静止原核，其余核退化。根据小核的形态特征，尾草履虫减数第一次分裂前期又分为I-V期，热处理III、IV期的细胞导致大量多小核细胞的形成。多小核细胞产生的原因很可能是热处理破坏减数分裂产物的正常退化，使该退化的核继续分裂，导致多个小核的形成。在前期工作中，通过吖啶橙/Hoechst 33342荧光染色，我们在形态学水平上证明尾草履虫减数分裂产物以凋亡的方式发生退化。本项目拟通过吖啶橙/Hoechst 33343等染色方法，将热处理组与对照组进行比较，确认在III、IV期进行热处理的细胞中减数分裂产物的凋亡是否受到破坏，再结合分子生物学的研究手段，探索诱导减数分裂产物凋亡的相关因子，进而从分子水平上研究减数分裂核凋亡/多小核细胞产生的机制.

使用吖啶橙/Hoechst 33342双重活体荧光染色，蛋白银染色以及a-微管蛋白单克隆抗体的免疫荧光染色三种方法重点对尾草履虫接合生殖期间的减数分裂、配前第三次分裂过程中小核的行为、命运以及在细胞质中出现的特殊结构进行了较为详尽的观察和分析。虽然关于尾草履虫接合生殖经典形态学工作完成于1907年，但是本项目的实施有了一些新发现，澄清了一些长期以来难以解释的现象的原因。1)关于减数分裂产物何时进入口旁锥，经典著作中描述为减数分裂结束后。通过大量细胞的观察和统计分析发现，在减数第二次分裂后期至末期之间至少有一核位于口旁锥。在后期，部分细胞的减数分裂产物位于或移向口旁锥，在末期，所有细胞中的口旁锥内至少有一个核位于其中，表明决定减数分裂产物命运是一个较长的过程，在减数第二次分裂后期开始启动。2)早在1907年，人们已经清楚，位于口旁锥内的核能够存活，位于口旁锥外的核发生退化。至于同一细胞中的减数分裂产物为何有如此不同的命运，一直以来都是一个谜。本项目的实施使项目组发现，减数分裂结束后，四个核的核膜下均有微管结构将其染色质紧紧包围。但是随着配前第三次核分裂的进行，口旁锥内核周围出现大量胞质内微管，口旁锥外核周围不但无胞质内微管出现，甚至核内的微管亦逐渐消失。这种胞质内微管在迁移原核和静止原核周围也有分布，但是在原核交换时期，所有胞质内微管全部消失，表明胞质内微管是时期特异性出现的，与减数分裂产物的生存/退化密切相关。3)在前期工作中，项目组证明位于口旁锥外的尾草履虫的减数分裂产物以凋亡方式发生退化。进一步的研究发现，在真核单细胞的尾草履虫中，亦存在类似高等动物中的凋亡小体。同时，第四双小核草履虫和绿草履虫的多余的减数分裂产物亦以凋亡的方式发生退化。4)在原核交换以前，静止原核一直位于迁移原核附近。通常，在动物细胞分裂过程中，纺锤丝向前后方向延伸，两个细胞核分配到两个子细胞中。因此，导致尾草履虫静止原核和迁移原核左右相邻的空间位置分布也是一个未解之谜。本项目研究表明，尾草履虫配前第三次核分裂过程中，纺锤丝(核间连丝)连续发生两次同向的90°角转动，结果导致两种原核左右排列。截至目前，在其他生物中尚无此类现象的报告，实属重要的生物学发现。5)从蟾蜍皮肤cDNA 文库中筛选出多个与细胞凋亡和癌症发生等相关的基因并获得部分基因的重组蛋白表达。