哺乳动物骨骼肌特异性合成启动子文库构建及筛选

构建组织特异性合成启动子，是基因治疗研究的重要内容。本项目革新设计了人工合成启动子文库的构建方案，用于合成有生物学活性的顺势调控元件。选择5个肌源性调控元件（Sp1、myogenin、MEF2、TEF-1和SRF）保守序列 ，合成具有一定几何序列的DNA单链，经磷酸化、退火形成DNA双链，用T4 DNA连接酶随机连接DNA双链，回收DNA片段，将这些片段进行PCR扩增，利用T/A克隆方法，将扩增的DNA片段克隆入牛α-actin基因核心启动子的上游，构建合成启动子文库；用真核基因表达技术，高通量检测报告基因红色荧光蛋白和荧光素酶，Northern验证，体外筛选细胞特异性强启动子；用小鼠骨骼肌电穿孔转基因技术，检测血清中分泌型碱性胎盘磷酸酶，体内检测合成的骨骼肌特异性强启动子，为骨骼肌作为基因治疗的靶器官提供组织特异性强启动子。

利用Golden Gate克隆法，将5个肌源性调控元件（Sp1、myogenin、MEF2、TEF-1和SRF）保守序列随机连接，插入牛α-actin基因核心启动子的上游，获得合成启动子文库。由于小鼠成肌细胞系C2C12脂质体转染效率极低，阻碍了体外活性检测步骤。项目组将继续研究优化C2C12细胞转染方案。.项目重点研究了“Golden Gate”克隆法中如何确定缓冲溶液的问题。由于反应体系中缓冲液对IIS型核酸内切酶和T4 DNA连接酶活性有很大影响，而T4 DNA连接酶在多种限制性内切酶中都有活性。因此，当将IIS型核酸内切酶和T4 DNA连接酶置于同一反应体系中时，可以考虑首选IIS型核酸内切酶缓冲液作为反应体系的溶液，即满足内切酶的活性，也能够满足DNA连接酶活性。