基于ανβ6/TGF-β1/Smad信号通路探讨白及药效组分抗肺纤维化作用机理

ανβ6/TGF-β1/Smad signal transduction pathway plays very important role during pulmonary fibrosis. Our prior study indicated that, active fraction EFBS separated from traditional Chinese medicine Bletilla striata could significantly reduce TGF-β1 and ανβ6 level on experimental silicosis rat model, and dramatically reduced pulmonary fibrosis. Hence, we hypothesized that, EFBS may educe its anti-pulmonary fibrosis effect through the regulation of ανβ6/TGF-β1/Smads signal transduction pathway based on the central role of TGF-β1 in the course of pulmonary fibrosis, and ανβ6 on mediating TGF-β1 activation. Therefore, this project aims to establish the ανβ6 over expression cell model, with specific inhibitor of this signal pathway as positive control and using flow cytometry, Western blot, and fluorescence quantitative PCR technology, to discuss the regulative effects of EFBS on the ανβ6/TGF-β1/Smad signal transduction pathway on alveolar epithelial cell, and to uncover its molecular targets. Moreover, TGF-β1 induced ανβ6 expression cell model was setup to research the regulation effect of EFBS on ανβ6/TGF-β1/Smad signal transduction pathway through inhibition ανβ6 expression, and analysis the multi-target, multi-effect and synergistic effect property of EFBS as an active fraction of traditional Chinese medicine.

ανβ6/TGF-β1/Smad信号通路在肺纤维化过程中起重要作用。项目组前期研究表明，中药白及药效组分EFBS可显著降低矽肺大鼠TGF-β1和ανβ6水平，显著降低肺纤维化。鉴于TGF-β1在肺纤维化过程中的核心地位，及ανβ6对TGF-β1的介导活化作用，我们推测，EFBS可能通过调控ανβ6/TGF-β1/Smad信号通路发挥作用。因此，本项目拟构建ανβ6过表达细胞模型，以该信号通路抑制剂为阳性对照，采用流式细胞术、Western blot、荧光定量PCR等技术分析EFBS对肺泡上皮细胞ανβ6介导的TGF-β1活化上游及TGF-β1信号传递下游可能作用靶点；同时，建立TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞ανβ6表达细胞模型，探讨EFBS是否可以通过抑制ανβ6表达，进一步促进对ανβ6/TGF-β1/Smad信号通路的调控作用，分析其多靶点、多效应、协同作用特征。

项目组采用谱效关系方法，系统定位了白及抗炎活性主要贡献峰；然后采用柱色谱和波谱解析技术，分离、纯化鉴定了其中4个主要峰，其分别为贝母兰宁、山药素III、3’-O-甲基山药素III和3-羟基-5-甲氧基联苄；其中前三者在白及中的含量较高，因此以这三个化合物为主要指标，建立了超高效液相色谱检测条件，对60个不同产地白及在相同条件下种植后这三个主要成分含量进行了对比分析，发现不同产地白及化学组成差异不大，但三个成分含量具有一定的地域性差异，且华白及中含量稍高于白及，这一结果为今后白及品种选育和质量标准建立提供了借鉴。进一步以上述四个化合物为目标，采用聚酰胺柱色谱法富集了一个白及抗炎药效活性组分EFBS，其中上述四个化合物含量分别达15.8800%、32.4891%、6.9611%和2.5099%，其总和大于50 %。EFBS可剂量依赖性抑制IL-1β、IL-6、TGF-β和TNF-α表达，且在5 μg/mL处理浓度即对IL-1β、IL-6和TGF-β表现出强烈的抑制率活性，但对TNF-α的抑制率活性相对较低。最后，本项目采用荧光定量PCR、流式细胞术、全自动western blot等方法对白及抗炎活性部位EFBS抑制ανβ6/TGF-β/Smad信号通路作用及其分子机理进行了初步探讨。结果表明，TGF-β可通过TGF-β/Smad通路上调ανβ6和间质细胞标记分子Vimentin等表达，并实现内皮细胞间质转化（EMT）；而白及有效组分EFBS可以通过阻断smad2磷酸化剂量依赖性抑制ανβ6表达和EMT转化。综合分析，白及药效组分EFBS可通过抑制TGF-β等炎症因子表达、分泌发挥抗肺纤维化活性，也可进一步通过抑制“中枢分子TGF-β”下游通路TGF-β/Smad信号传递抑制EMT转化减少胶原沉积，同时也可以阻断TGF-β/ανβ6/TGF-β环路防止信号级联放大减缓肺纤维化进程。EFBS这一效应体现了中药多靶点、多效应的作用特点；因此，本研究为今后白及科学开发利用奠定了良好基础。