马铃薯晚疫病菌交配型位点的精细遗传图谱构建及定位研究

Phytophthora infestans is the potato pathogens within genus of diploid and heterothallic oomycetes,this species co-existing A1 and A2 mating types. Previous works has not been cleared about the mating type gene mapping and sexual reproduction characters. As the important cause of disease occurrence and prevalence during sexual reproduction stage, this study focus on mating type analysis of P. infestans isolated from Yunnan province, we induced F1 and F2 sexual offsprings to find out sexual separation principle between two mating types; using protoplast fusion method to understand the location of the mating type locus in cell. Meanwhile, several mating type linked primers designed by previous works were attempted to test whether mating type genotype linked with phenotype; screening high quality SNPs in F2 gerenation by compared genomic analysis method and Bulk Segregate Analysis methods among A1、A2、A1A2 and self-fertile DNA pools; design CAPs markers within selected SNPs area to test co-separation in F2 generation; finally,using MapMaker software to construct candidate genetic mapping of the mating type locus.

Phytophthora infestans是引起马铃薯晚疫病的病原，属于二倍体异宗配合卵菌，存在A1和A2两种交配型，目前关于该病原菌有性生殖特点和交配型决定位点的研究，是不明确的。鉴于晚疫病菌有性生殖对病害发生和流行的重要性，本研究以云南省马铃薯晚疫病菌分离群体为基础，首先诱导产生有性F1和F2代群体以明确交配型的分离规律；采用原生质体融合法了解交配型决定位点在细胞中的定位；在此基础上，用前人报道的交配型相关检测引物对F2代分离群体进行连锁检测；接下来用分离群体分组分析法，对F2代A1、A2、A1A2和自育型菌株DNA混合池进行核基因组或线粒体基因组的重测序，拼接，用比较基因组分析法筛选高质量的SNPs后在其周围设计一系列CAPs标记，在F2代中进行基因型和表型的共分离检测；最后利用MapMaker软件完成交配型决定位点的精细遗传图谱。

马铃薯晚疫病(potato late blight，PLB)是马铃薯生产上的第一大病害，由卵菌纲致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起，导致连年减产及防治困难，对我国粮食安全及自给自足造成了重要威胁。.P. infestans 是异宗配合卵菌，存在交配型，其生活史包含无性生殖阶段和有性生殖阶段，其中有性阶段主要负责病原菌越冬、抗逆境和变异。在前期研究中已经证实，晚疫病菌有性生殖在全球各马铃薯主产区普遍发生，导致了病原菌群体结构快速变异，因而使得寄主抗病性降低甚至丧失，病原菌抗药性变强，最终导致种植季病害发生的提前和病害流行程度加重。因此，探究病原菌群体动态变化特点及有性生殖发生控制的位点，有利于掌握病害流行的趋势，了解有性生殖发生的机制，开发对应的药物靶标。本研究利用采集的357个致病疫霉菌株，首先分析了云南省12年马铃薯晚疫病发生趋势、病原菌群体结构变化和流行趋势，揭示了有性生殖发生和寄主选择压力是群体结构变化的两个最重要原因；通过胞质DNA多态性遗传分析，基本证实了交配型决定性状的相关位点不在细胞器DNA上而是位于细胞核；研究构建了400株F1-F4代有性生殖分离群体，掌握了交配型分离规律，解析了有性生殖的发生对部分无毒基因毒性变化的特点；利用BSA分析方法，对分离群体F4代A1,A2,A1A2和SF群体进行了深度测序，共找出和交配型位点连锁的SNP 49,737个，经过筛选、过滤，对236个候选位点进行遗传分析，分别构建了亲本A1长度为1588 cM, A2长度784 cM的遗传图谱，定位了5个和交配型相关的QTLs。另外，本研究也探索了病原菌的高效病原菌原生质体制备和遗传转化方法。