紫红链霉菌大质粒pSV1复制与调控的分子机理研究

Streptomyces bacteria are Gram-positive, and have genomes with high GC content. More than 6000 antibiotics and other bioactivite metabolites have been reported produced by different species of Streptomyces. pSV1 is the largest circular plasmid found in Streptomyces, and it constains a complete methylenomycin biosynthesis gene cluster. However, the mechanism of pSV1 replication and regulation is not known. By improving the manipulation and detection techniques, our group has clearly detected pSV1, and found the basic elements involving in its replication functions. This project will characterize the mechanism of pSV1 replication and regulation at the genetic and biochemical levels, including the determination of the transcription start of the replication gene repL1 and the regulation gene repL2, and their specific interaction with the Iteron and NCS sequences, and the impact of the regulation protein on the replication and the copy number control of pSV1. A preliminary model of RepL2-RepL1-iteron-NCS replication and regulaiton will be estabilshed. Base on the above research results, a vector suitable for the large DNA fragments cloning could be developed.

链霉菌是高GC含量革兰氏阳性菌，已报道链霉菌的不同种产生约6000种抗生素和生理活性物质。pSV1是链霉菌中已发现的最大的环型质粒，并含有完整的次甲霉素合成基因簇，但是关于pSV1的复制和调控机制的研究尚处空白。本实验室通过改进操作和检测手段，首次清晰地检测到了pSV1质粒，并找到了其复制相关的基本元件。本项目拟在遗传和生化水平上精细分析pSV1复制和调控的机制，包括鉴定复制基因repL1和调控基因repL2的转录起始，与iteron和NCS序列的结合的特异性和确定精确结合序列，调控蛋白对质粒复制和拷贝数的影响和可能机制等。初步建立RepL2-RepL1-iteron-NCS复制和调控的模型。在此基础上，尝试发展新的可进行大片段DNA克隆的载体。

链霉菌是基因组为高GC含量的革兰氏阳性菌，已报道链霉菌的不同种可以产生约6000种抗生素和生理活性物质。约163-kb的质粒pSV1是链霉菌中已发现的最大的环型质粒，并含有完整的次甲霉素合成基因簇，但是关于pSV1的复制和调控机制的研究尚处空白。本项目从以下三方面在遗传和生化水平上精细分析pSV1质粒的复制和调控机制：.1..对质粒pSV1复制区的复制起始的研究。鉴定出质粒pSV1复制所必需的基本元件，包括repA基因，含重复序列区的ori区和一段300bp的非编码区。纯化的RepA蛋白可以特异结合95 bp的反向重复序列。RepA 蛋白之间在体外可以形成双体和三体。我们提出了一个RepA 蛋白与重复序列结合的模型。另外，通过对NCS区功能的研究，首次发现了影响链霉菌发育分化和抗生素产生的调控蛋白BldD可以正调控质粒pSV1的复制。.2..对质粒pSV1的拷贝数控制的研究。实验证明repA基因与下游repB基因共转录，敲除repB基因使得质粒的拷贝数比野生型增加了约50倍。RepB蛋白可以结合repA基因的启动子，实现对repA基因转录的调控。RepB蛋白还可以结合到ori区的两段重复序列。RepB蛋白之间可以形成二聚体，暗示RepB与ori区可能形成“手铐”（handcuff）结构来控制质粒的拷贝数。此外，RepB蛋白也可以通过作用于二段重复序列来实现对另一个链霉菌质粒SCP2的拷贝数负控制。我们提出了一个复制调控蛋白RepB具有多重负调控作用的模型。.3..对质粒pSV1的全序列进行测定和分析。利用高通量鸟枪测序法和PCR拼接，获得了pSV1的完整序列，全长共163227 bp。对质粒pSV1的全序列进行分析，发现了第二个复制区。第二个复制区已克隆并证明具有完整的复制功能。质粒pSV1序列中还存在编码噬菌体结构蛋白的基因，次甲霉素生物合成基因簇，四型分泌系统基因，CRISPR基因簇等特殊功能的基因