线粒体自噬在腺苷A2B受体活化诱导心肌再灌注保护中的作用及机制研究

Myocardial ischemia/reperfusion injury is a common pathological process, which seriously affects the survival and prognosis of patients with myocardial infarction. Mitochondrial oxidative stress is regarded to be the chief cause of myocardial ischemia/reperfusion injury. Previous study has demonstrated that activation of adenosine A2B receptors prevents myocardial damage by decreasing mitochondrial oxidative stress at early reperfusion. However, the protective effect of adenosine A2B receptor activation decreases with time and the mechanism is not clearly underlined. It is generally believed that mitophagy prevents myocardial reperfusion injury by removing the damaged mitochondria. But our previous study has demonstrated that mitophagy is inhibited by adenosine A2B receptor activation which may be a key contributor to lessen the protective effects of adenosine A2B receptor activation. The overall objective of this project is to investigate the effects and mechanisms of mitophagy on adenosine A2B receptor activation-induced protection against myocardial reperfusion injury. This project will test the hypotheses that: 1) Mitophagy up-regulation increases the cardioprotective effect of adenosine A2B receptor activation during reperfusion; 2) The adenosine A2B receptor activation suppresses mitophagy by regulating the mitophagy receptors via Src tyrosine kinase; 3) The activation of mitochondrial adenosine A2B receptors could inhibit mitophagy.

心肌缺血/再灌注损伤是临床常见的病理过程，严重危害心肌梗死患者的生存和预后。线粒体氧化应激损伤是引起心肌缺血/再灌注损伤的重要原因。研究表明腺苷A2B受体活化减轻再灌注早期的线粒体氧化应激损伤，保护心肌。但随再灌时间延长，腺苷A2B受体活化对心肌的保护作用减弱，其原因尚未阐明。人们普遍认为线粒体自噬通过清除损伤线粒体，来减轻心肌再灌注损伤。但我们的前期研究发现腺苷A2B受体活化抑制线粒体自噬，提示这可能是腺苷A2B受体活化保护心肌的一个负性因素。本课题将探讨线粒体自噬在腺苷A2B受体活化诱导心肌再灌注保护中的作用及机制。为此，我们将利用生理学、药理学、分子生物学和蛋白质组学等方法验证如下假设：1）上调线粒体自噬增强腺苷A2B受体活化诱导的心肌再灌注保护作用；2）腺苷A2B受体活化，激活线粒体Src酪氨酸激酶，调控线粒体自噬受体，抑制线粒体自噬；3）线粒体膜腺苷A2B受体活化抑制线粒体自噬。

心肌缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion，I/R）损伤是临床常见的病理生理过程，严重危害了患者的生存和预后。线粒体损伤是加重心肌再灌注损伤的重要原因。我们之前的研究证实腺苷A2受体活化通过激活线粒体Src酪氨酸激酶，抑制呼吸链复合体Ⅰ活性，减少活性氧产生，进而减轻再灌注诱发的心肌线粒体损伤。但我们也发现腺苷A2B受体活化对心肌线粒体自噬具有抑制作用。因此，本研究探讨了线粒体自噬在腺苷A2B受体活化诱导心肌再灌注保护中的作用及其具体机制。我们的研究发现：1、Western-blotting和透射电镜检测发现选择性腺苷A2B受体激动剂BAY606583（BAY）抑制再灌注时心肌细胞自噬和线粒体自噬；2、上调线粒体自噬增加BAY的抗心肌再灌注损伤作用；3、选择性Src酪氨酸激酶抑制剂PP2减弱BAY对线粒体自噬的抑制作用；4、共聚焦检测发现BAY降低LC3和线粒体标志蛋白Tom20的共定位，减少线粒体和溶酶体的共定位，但此作用被PP2抑制；5、BAY降低再灌注时FUNDC1和PINK1/Parkin的表达水平，PP2抑制此作用；6、免疫共沉淀，蛋白互作分析和蛋白磷酸化位点预测表明Src酪氨酸激酶可能通过促进FUNDC1酪氨酸位点磷酸化，对其进行调控；7、免疫电镜、免疫荧光和Western-blotting证明线粒体膜腺苷A2B受体的存在具有普遍性；8、线粒体膜腺苷A2B受体活化能够激活线粒体Src酪氨酸激酶，抑制呼吸链复合体的活性；9、我们设计了靶向缺血心肌线粒体的腺苷A2受体激动剂，这将有助于对线粒体腺苷A2受体功能的研究。结论：腺苷A2B受体活化，激活线粒体Src酪氨酸激酶，下调线粒体自噬相关因子FUNDC1和PINK1/Parkin的表达，阻碍损伤线粒体被溶酶体识别，抑制线粒体自噬，减弱了其抗再灌注损伤保护作用。线粒体膜腺苷A2B受体的存在具有普遍性，并且其活化能够激活线粒体Src酪氨酸激酶，抑制呼吸链复合体的活性。