水氮胁迫下草地早熟禾氮代谢及其利用效率调控机制

Kentucky bluegrass (Poa pratensis L.) is the most commonly used cool season turfgrass in Northern China, where water and nitrogen(N) are two key factors influencing turf quality. Lack of water leads to reduce N absorption and metabolism and lose soil N. Therefore, cultivating species that has high water and N use efficiency is important to solve this problem. The objectives of this research are to investigate N metabolism and regulation mechanism of different species of Kentucky bluegrass (including native Kentucky bluegrass) under water and N stress, which will be conducted by morphological, physiological, and molecular biological techniques. The research will include water and N stress influence N use efficiency and morphological structure, growth, and physiological metabolism of Kentucky bluegrass response to this stress; the relationship between expression pattern of Glutamine synthetase (GS) gene and aquaporin (PpTIP1) gene and N use efficiency and the mechanism of two genes on N synthesis and transportation. Finally, effective indicators of improving N use efficiency and water saving of Kentucky bluegrass will be screened out after comprehensive comparison of above research. The results will be important to support the theory of plant nutrient transportation and metabolism, as well as to be significant in practice in improving N use efficiency of Kentucky bluegrass further by transgenic technigues.

草地早熟禾（Poa pratensis L.）是我国北方应用最多的优良冷季型草坪草。水和氮素是制约其草坪质量的两个重要因素。水分缺乏造成植株氮素吸收和代谢能力下降，同时也易造成土壤氮素淋失。培育高肥效高水效品种是解决问题的重要途径。本研究采用形态、生理和分子生物学等综合技术，结合国有品种资源，探索水氮胁迫下草地早熟禾不同品种氮代谢变化规律及对氮素利用效率的调控机制。主要研究内容有：草地早熟禾形态结构、生长发育及生理代谢响应水氮胁迫对氮代谢及利用效率的影响；谷氨酰胺合成酶基因（GS）和水通道蛋白基因（PpTIP1）表达规律与氮代谢及利用效率的关系及二者在调节氮素合成和转运的功能及机制。综合比较分析筛选出提高草地早熟禾氮素利用效率和节水特性的有效指标。研究成果对丰富植物养分传输和代谢理论以及进一步通过转基因手段改良提高草地早熟禾氮素利用效率具有重要理论和现实意义。

围绕水分和氮素胁迫，进行草地早熟禾PpGSa、PpGSb、PpTip1 基因定量和定位表达，同时研究形态及生理代谢关键酶活性的变化。主要结果： Race 技术克隆PpGSa、PpGSb 全长分别为1480bp、1451bp。信息学分析表明：PpGSa、PpGSb全长cDNA的氨基酸序列与NCBI报道的物种GSa、GSb氨基酸序列同源性达80%以上。属于Gln-synt_N superfamily。PpGSa、PpGSb不稳定系数均小于域值，总平均疏水性分别为-0.239和-0.342。PpGSa蛋白质由20种氨基酸组成，其中Val、Pro、lle、Gly、Ala含量分别为6.9%, 7.1%, 7.1%, 10.1% 和 8.4%。PpGSb蛋白质由20种氨基酸组成，其中Asp、leu、lle、Gly、Ala含量分别为6.7%, 7.5%, 7.5%, 10.2% 和 8.9%。PpGSa、PpGSb的磷酸化位点分别有22个和18个，在多肽链中呈不均匀分布。PpGSa有三个N-糖基化位点，分别位于氨基酸残基第185、251、272处。PpGSb有两个N-糖基化位点，分别位于氨基酸残基第185、251处。定量表达研究表明，低氮在一定程度上利于PpGSa、PpGSb和PpTip1的表达，而高氮对其表达有抑制作用。重度干旱胁迫下，无论低氮还是高氮处理，基因的表达量都明显下调；不同品种的相对表达量有所不同。免疫组化定位研究表明，草地早熟禾GS蛋白主要定位在叶绿体和细胞质中，而PpTip1蛋白主要定位在液泡中。两个GS基因和PpTip1基因的定量表达与氮素供给呈相关变化。GS基因主要调节植株对氮素的初步吸收及氮素再利用，PpTip1参与调节氮素在液泡中的储藏和输出。电镜观察可知，随干旱胁迫加重，无论是中浓度氮素还是高浓度氮素处理，其导管直径都减小，筛管直径都略有增加，韧皮部面积也都增加，表明氮素的供给可改善韧皮组织结构输导养分能力，根部组织变化也表现了相同趋势。不同品种谷氨酸合成酶（GOGAT）随着氮素浓度的增加活性逐渐增强，但随水分胁迫的加重，其活性逐渐下降，不同氮素水平处理之间，差异性显著。谷氨酰胺合成酶（GS）在中度水分胁迫下，活性随着氮素浓度的增加呈先增强后减弱的趋势，品种间表现不同。