柑橘绿霉菌pH信号响应转录因子PacC基因的功能研究

柑橘绿霉菌（Penicillium digitatum）是采后柑橘腐烂的最主要病原。已有研究发现病菌分泌有机酸在致病过程中发挥着重要作用。PacC途径是真菌中广泛存在的pH信号响应途径，在构巢曲霉等模式真菌中该途径参与水解酶分泌、离子运输、代谢物合成和致病性等方面的调控。本实验室从T-DNA插入的绿霉菌突变体中筛选到一个致病性下降、插入位点为PacC同类基因的突变体。本申请拟以绿霉菌为模式，研究其转录因子PacC的生物学功能，明确PacC对外界pH和盐胁迫等信号的响应，在侵染过程中的表达，对产酸和致病性的调控。然后应用抑制差减杂交技术（SSH）构建绿霉菌野生型菌株和PacC缺失突变体的双向差减cDNA文库，结合生物信息技术，预测并鉴定PacC所调控的相关基因及其功能，并进行表达、启动子区PacC识别位点和功能分析验证，揭示产酸真菌PacC途径对致病性调控模式，为新防治技术研发提供科学依据。

序列比对和分析发现柑橘绿霉病菌（Penicillium digitatum）中存在与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)类似的pH信号响应途径，包含的基因PalA、PalB、PalC、PalF、PalH、PalI和PacC。该信号途径的末端转录因子PdPacC含有641个氨基酸，存在与构巢曲霉AnPacC相似的3个锌指结构域(57~145位，从起始密码子起，下同)以及信号蛋白酶识别位点(461~484位)，在启动子区(-222 bp到-723bp)含有4个PacC自身结合位点(5’-GCCARG-3’)。表达分析表明中性和碱性条件(pH≥7)、Na+胁迫和果胶处理均可诱导PdPacC，而在侵染过程中其表达不受果皮酸性pH环境影响，在感染初期呈现明显的升高，48h是对照条件(PDB中培养)的8.4倍。PdPacC缺失突变体对Na+、K+的敏感性增加，丧失在碱性条件(pH=8.0)下的生长能力，对果胶的利用能力下降，对柑橘果实的致病能力也显著下降，产生的病斑直径只有野生型的56.3%。而当重新导入缺失突变体时，缺失突变体的表型得以恢复。试验还发现，与野生型相比在侵染过程中ΔPdPacC突变株的内切多聚半乳糖醛酸酶(PG2)和果胶裂解酶(PNL1)上升表达丧失，进一步分析表明PG2突变株的病斑直径只有野生型的70%。综上所述，PdPacC是参与对Na+、K+及碱性胁迫的适应，并通过调控细胞壁水解酶影响致病性。. 研究还比较了ΔPdPacC突变株和野生型菌株在pH=7和PDB培养基和侵染寄主过程中的表达谱异同，明确了PdPacC调控的基因和代谢途径，同时还将之与产碱菌胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）进行比较。这部分工作正在进行中。