TCTP调节Mule介导的Mcl-1泛素化通路在脓毒症患者T淋巴细胞凋亡中的作用

Lymphocyte apoptosis has been recognized as an important step in the pathogenesis of experimental sepsis,by inducing a state of 'immune paralysis' that renders the host vulnerable to invading pathogens.Excessive lymphocyte apoptosis potentially play a crucial role in progonsis of patients with severe sepsis.Mcl-1,an anti-apoptotic Bcl-2 family member, appears to function at an apical step in many regulatory programs that control cell survival and death.Overexpression of Mcl-1 delays cells from undergoing apoptosis.The extremely labile nature of the Mcl-1 protein itself and the fact that the Mcl-1 level is a critical determinant in various cell survival pathways suggest that cellular processes that regulate Mcl-1 stability are as important as those that regulate Mcl-1 synthesis.TCTP bound to Mcl-1 and modulated the stability and antiapoptotic activity of Mcl-1 via interfering with Mcl-1's ubiquitin-dependent proteasome degradation,which was mediated by Mule,Mcl-1 ubiquitin ligase E3.However, whether Mcl-1 ubiquitination modulated by TCTP via Mule is involved in T lymphocyte apoptosis in sepsis patientsis is elusive. We measure apoptosis in circulating lymphocytes from patients with severe sepsis, and treate HUT-78, pretransfected with TCTP, Mcl-1 cDNA or Mule siRNA,with serum from patients with sepsis, then, measure lymphocyte apoptosis, the mRNA and protein level of TCTP,Mcl-1 and Mule,the ubiquitin-dependent degradation of Mcl-1,aim to learn the effect of Mcl-1 ubiquitination modulated by TCTP via Mule on T lymphocyte apoptosis in sepsis patients.

淋巴细胞过度凋亡对脓毒症患者预后可能具有决定性作用，但其凋亡机制不清。研究发现，TCTP结合Mcl-1可减少Mule介导的Mcl-1泛素化降解。而作为Bcl-2家族成员之一，Mcl-1表达可抑制凋亡。但关于TCTP调节Mcl-1泛素化降解是否参与脓毒症患者淋巴细胞凋亡，未见报道。本课题通过TCTP 、Mcl-1 基因转染、Mule siRNA等干预脓毒症患者血清诱导的HUT-78细胞凋亡，并用Real-time PCR、免疫印迹法、免疫共沉淀、共聚集显微镜等技术观察淋巴细胞凋亡、TCTP、Mcl-1、Mule mRNA及蛋白表达、结合及其Mcl-1泛素化降解水平，以深入研究TCTP调节Mule介导的Mcl-1泛素化通路在脓毒症患者淋巴细胞过度凋亡中的关键作用。

脓毒症是一种由全身严重感染所导致的全身炎症反应综合征，病情极其危重，预后极差。目前研究认为，脓毒症发生过程中，既可表现为过度炎症反应，也可同时表现为全身免疫功能抑制甚至麻痹，而免疫功能抑制程度则与其预后直接相关，淋巴细胞凋亡导致淋巴细胞减少可能是免疫抑制的重要机制。Mcl-1作为Bcl-2家族成员之一，其表达可抑制细胞凋亡的发生，但Mcl-1 蛋白体内极不稳定易被降解。TCTP结合Mcl-1可减少其泛素-蛋白酶体降解，增加Mcl-1的稳定性，这是抗凋亡所必须。但关于TCTP对Mcl-1的泛素蛋白酶体降解的影响是否参与脓毒症患者淋巴细胞凋亡未见报道。本实验主要探讨全身炎症反应综合征（包括脓毒症）患者外周血T淋巴细胞亚群和T淋巴细胞凋亡的变化及其与预后的关系，TCTP调节Mcl-1泛素化降解在脓毒症T淋巴细胞凋亡中的作用。结果发现脓毒症患者外周血T淋巴细胞各亚群计数明显减少，CD3+T淋巴细胞凋亡明显增加，尤以死亡组改变最为明显，T淋巴细胞各亚群计数与APACHEⅡ评分呈负相关。在体外实验中，脓毒症患者血清可诱导Jurkat淋巴细胞凋亡增加、Cleaved-caspase3表达上调，抗凋亡蛋白Mcl-1，Bcl-2表达下调，尤以脓毒症死亡组改变更为明显；脓毒症中所产生的最重要细胞因子之一TNFα也可呈剂量依赖性增加Jurkat细胞的凋亡。放线菌酮抑制蛋白质合成后，TNFα刺激Jurkat细胞内Mcl-1表达水平随时间逐渐减少；放线菌酮与蛋白酶体抑制剂同时处理细胞后，Mcl-1水平随时间没有明显减少，提示Mcl-1降解主要通过蛋白酶体途径降解，可能是通过泛素化通路。我们进一步通过免疫共沉淀检查证实了TCTP与Mcl-1之间具有相互作用。siRNA技术敲低TCTP后Jurkat细胞MCL-1表达减少，cleaved-caspase3表达上调提示凋亡增加；敲低Mcl-1后Jurkat细胞cleaved-caspase3表达上调提示凋亡增加，而TCTP的表达不受Mcl-1的调节。上述研究表明TCTP调节Mcl-1泛素化通路在脓毒症患者T淋巴细胞凋亡中发挥了关键作用，本课题系统而深入地从Mcl-1泛素化通路角度回答脓毒症患者T淋巴细胞凋亡机制及其与预后的相关性这一科学问题，为临床上防治淋巴细胞过度凋亡改善预后提供实验基础。