基于AMPK/mTOR信号通路调控心脏微血管内皮细胞自噬探讨通冠胶囊改善心室重构的机制研究

The microcirculation caused by damage of microvascular endothelial cell plays a key role in the ventricular remodeling after myocardial infarction. The autophagy mediated by AMPK/mTOR pathway also plays an important role in this process. Previous studies have confirmed that Tongguan Capsule can inhibit ventricular remodeling, which is associated with regulating the autophagy. Therefore, we hypothesized that Tongguan capsule can induce autophagy of endothelial cell so as to suppress ventricular remodeling. To confirm this hypothesis, we'll construct ventricular remodeling model by ligating coronary artery, detecting autophagosome and marker protein to evaluate the level of autophagy, endothelial function, microcirculation, cardiac function, to evaluate the influence of Tongguan Capsule on the autophagy of endothelial cells in ventricular remodeling. Further, in culture of cardiac microvascular endothelial cells, we analysis the mechanism underlying Tongguan Capsule regulating the autophagy. This study will be meaningful in studying the effect of the autophagy of microvascular endothelial cell in prevention and treatment of ventricular remodeling using Chinese medicine with supplementing qi, promoting blood circulation and dredging collaterals, and exploring the new integrative Chinese and Western Medicine treatment in ventricular remodeling after myocardial infarction.

微血管内皮细胞损伤致微循环障碍是心肌梗死后心室重构的关键病因，AMPK/mTOR通路介导的自噬在其中发挥重要作用。前期研究发现益气活血通络中药通冠胶囊能够抑制心室重构，且与调控自噬相关。据此我们提出科学假说：通冠胶囊通过AMPK/mTOR通路调控微血管内皮细胞自噬、减轻微循环障碍而改善心室重构。本研究拟构建心梗后心室重构小鼠模型，观察通冠胶囊对自噬潮、内皮功能、微循环、心功能的影响，以评价微血管内皮细胞自噬在通冠胶囊改善心室重构中的作用；进一步离体培养心脏微血管内皮细胞，沉默AMPK或者过表达mTOR等通路蛋白，解析通冠胶囊调节自噬的信号转导通路。本研究将益气活血通络中药防治心室重构的机制与微循环相联系，探讨微血管内皮细胞自噬在其中发挥的关键作用，对于阐明气虚血瘀阻络发病理论及生物学基础，深化益气活血通络治法的科学内涵，发现心室重构新的作用靶点和治疗策略具有重要的意义。

前期研究发现益气活血通络中药通冠胶囊能够抑制心室重构，且与调控自噬相关。为证实本研究假说：通冠胶囊通过AMPK/mTOR通路调控细胞自噬而改善心室重构，本研究构建了心梗后心室重构小鼠模型，观察通冠胶囊对自噬、凋亡、心功能的影响。① 结果证实与模型组小鼠比较，通冠胶囊抑制心肌梗死小鼠左心室扩张、提高左室射血分数，缩小心肌梗死瘢痕周径、减少心肌纤维化、改善微循环（动物超声、病理染色、免疫印迹）；② 通冠胶囊减少细胞凋亡（免疫印迹、激光共聚焦检测），同时增加自噬（免疫印迹检测LC3II/I、Atg5、p62；电镜检测自噬体、激光共聚焦检测LC3II）；③ 通冠胶囊抑制金属蛋白质酶MMP2/MMP9和TGFβ1通路蛋白表达（免疫印迹、病理染色）；④ 通冠胶囊增加AMPK磷酸化水平、抑制mTOR磷酸化； ⑤ 通冠胶囊上述作用能被自噬阻断剂（氯喹）或AMPK 特异性阻断剂组剂（Dorsomorphin）抑制或减弱（动物超声、病理染色、电镜、免疫印迹、激光共聚焦检测）。为进一步探索通冠胶囊调节自噬的信号转导通路，本研究离体培养心脏微血管内皮细胞，构建缺氧模型，结果证实：⑥ 与模型组比较，通冠胶囊血清组细胞损伤减轻，自噬体显著增加（ELISA、电镜、激光共聚焦检测）； ⑦ 通冠胶囊增加磷酸化AMPK、Atg5、Atg7蛋白表达，而氯喹或shRNA-AMPK抑制通冠胶囊血清诱导自噬的作用（免疫印迹）；⑧ 通冠胶囊抑制TGFβ1诱导的心肌成纤维细胞表达的纤维化相关蛋白（免疫印迹）； ⑨ 使用iTRAQ技术分析了心脏微血管内皮细胞缺氧模型的差异蛋白，证实通冠胶囊血清干预后，炎症反应、代谢、ATP合成等生物学过程都显著改变。本研究证实了益气活血通络中药（通冠胶囊）改善心室重构过程中微血管内皮细胞自噬发挥的关键作用，有助于为中西医结合治疗心肌梗死心室重构找到切入点并开拓新的思路。